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(民國 88 年 08 月 02 日修正)
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壹 前言
健康食品的免疫調節功能評估，是針對包括非特異性及特異性免疫功
能之評估。所調非特異性免疫力主要包括如中性白血球 (neutrophil
s)及單核球 (monocytes)的吞噬能力或是自然殺手細胞的活性 (natu
ral killer activity) 。而特異性免疫力主要是針對一些特定的抗
原作進一步的評估，在老鼠身上可以利用外加注射一些特定的抗原，
再進行抗原特異性免疫反應的評估，其中可以包括如特異性抗體的測
定或是抗原特異性的 T細胞增殖反應和細胞激素的研究。至於人體的
抗原特異性免疫力的評估，則可能必須與疫苗注射來合併進行。同時
，如果要評估免疫細胞的功能時，應該分別由質與量兩方面來加以分
析。量方面主要是測定各種免疫細胞的數目，目前利用螢光流體計數
儀可以容易地將免疫細胞正確地計算出。由於免疫功能在正常人或是
為數不少的疾病都扮演著一個重要的關係，未來如果要更正確地評估
健康食品在這些免疫疾病上的可能調節功能，也許需要另外建立動物
模式或是經由人體的臨床試驗來加以評估這些功能。
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貳 實驗方法
一 動物實驗
實驗動物：建議選用小鼠，常用的 Balb/c 或是 B6 小鼠皆可， 6-8
週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組隻數為單一性別至少 10 隻。
(一) 非特異性免疫反應
1 脾臟或是淋巴結細胞增殖反應：
－T 細胞建議使用如Con A 或是 Phytohaemagglutinin (PHA)的
裂殖素 (mitogen)，或是利用交叉連結 (cross-linking)抗 CD3
抗體來刺激。
－B 細胞建議使用 Lipopolysaccharide (LPS) 來刺激。
進行步驟：
(1) 3Ｈ-thymidine incoroperation 法：
方法較靈敏，將脾臟細胞 2x10000000/ml 置於96-well plate
，再加入 Rosewell Park Memorial Institute 培養基 (RPMI
) 或添加有LPS, Con A, PHA 等細胞裂殖素的培養基。3於7℃
ＣＯ2培養兩天後，加入1 μCi/well 3Ｈ-thymidine，繼續培
養 20 小時後，以 cell harvester 收集細胞於濾紙上，濾紙
風乾後以閃爍計數儀測 3Ｈ-thymidine 含量，計算細胞增生
能力。
(2) MTT 法
MTT 的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，
產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞
裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會
較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定
細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確
度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意
。
(3) 螢光流體計數儀來測定 DNA的染色：
利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激，細胞核內的 D
NA是否有任何變化，可以分別利用 Propidium iodide (PI)及
bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。PI可以在染色後
直接利用螢光流體計數儀加以分析，但是 BrdU 的方戶法則需
要再加上一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光，才能利用螢光流
體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的 DNA有增
加的變化，可以同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用
抗 CD3及抗 B220 抗體先行染色，再將細胞加以固定，然後進
行 DNA的染色。可以對細胞的表面標記及細胞內的 DNA螢光使
用不同波長的螢光，以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞
進行分析。如果能夠達到此一目的，便能夠不需要將細胞分離
出就可以知道是那些細胞受到活化。
2 抗體分泌實驗
血液中免疫球蛋白濃度：目前測定血清內免疫球蛋白的濃度，最
常利用到的方法為 Radio immunodiffusion (RID) 法，此種方
法在使用上較為方便，只要將血清放入培養孔中，靜置 24 至48
小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，便可以算出免疫球
蛋白濃度。除此外，也可以利用 sandwich-ELISA ，或是生化的
方法將免疫球蛋白的濃度計算出來，但是生化的方法可能必須在
較具規模的醫學中心才能作得到。
3 細胞激素分泌實驗將分離出的淋巴球以 2x10000000 /ml 的濃度
置於 24-well 的 Plate 中，利用已經定量過的 Con A或抗 CD3
抗體來刺激這些淋巴球。經過 24 到 48 小時的培養後，將上層
液離心下來，以測定其淋巴介質製造的量。在取得足夠檢體以前
，可將其它檢體先保存在 -70℃，等到檢體足夠時再一起測試。
淋巴介質的測定是利用 (sandwich-ELISA法。先利用一個抗淋巴
介質的抗體先覆蓋在 ELI SA plate 上，在 4℃靜置一晚。在進
行實驗前先以 1％ PBS-BSA 處理後清洗之。再將要處理的檢體
加到 plate上，置於室溫 2小時後加入 biotin 聯結的抗淋巴介
質抗體。兩小時的室溫靜置後，加入 avidin 聯結過氧化酵素 (
avidin-linked peroxidase) ，再靜置二個小時後加入受質以呈
色。上述裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其
最適當的濃度，並以已知濃度的淋巴介質作為對照。
4 分離脾臟細胞及表面標記分析：
利用頸椎脫臼法分別犧牲老鼠，將脾臟取出並製備成單一細胞懸
浮液，更進一步利用 Tris-Ammonium chloride 緩衝液將紅血球
懸浮，而白血球則利用 Hank's 溶液清洗三次後再進行下一步的
實驗。將單一白血球分離出後，利用 Fluorescein isothiocyan
ate(FITC) 及 Phycoerythin(PE) 染色的單株抗體來計算不同表
面標記的比例及數目。這些細胞表面標記的測定將利用於 Fluor
escence Activated Cell Sorter(FACS) 分析法。
5 自然殺手細胞活性：
為要測定實驗動物之自然殺手細胞的活性，可以先培養自然殺手
細胞的標的細胞 (YAC-1 細胞株) 。原則上也是將 YAC-1 細胞
與 51Cr 先在一起培養約 4小時，再將殘餘在試管中而未移除的
51Cr除去。此時再加入不同數目的單核球 (monocyte) 與已經與
51Cr培養過的標的細胞一起培養，在培養一段時間後取出上清液
，放入g-counter內計算其放射強度。在實驗的過程中，利用 NP
-40 或是 HCl將細胞破壞，以取得51Cr 的最高釋放值。
實驗值－背景值
計算公式＝ ------------------------------------------
最高釋放值－背景值 ×100﹪
6 吞噬細胞活性：
吞噬細胞可以分別測定單核球(monocyte)或是中性白血球的吞噬
能力，目前可以分別利用吞噬細菌如 E. coli、yeast 等方法來
加以測定，也可以利用已標記好的 E. coli (如螢光) ，在細胞
吞噬後利用螢光流體計數儀來加以分析。
(二) 特異性免疫反應
以卵白蛋白 (ovalbumin,OVA) (或其他抗原如羊紅血球)對老鼠
行腹腔注射，以得到抗體生成的曲線圖及時間表。老鼠在餵食一
個月的飲食後，先採血，以作為整個實驗過程的基本值。開始注
射卵白蛋白 OVA 致敏老鼠，以得到 OVA 特異性 IgG 及 IgM
的產生。每隻老鼠注射 2μl Complete Freunds Adjuvant 入腹
腔內，兩週後再腹腔注射 6μl Incomplete Freunds Adjuvant
為追加致敏。定期採血以追蹤血清中 OVA 特異性 IgG 及 IgM
的濃度。
光值。
1 OVA 誘發的特異性抗體產生
首先以 100μl 的 10μg/ml OVA 覆蓋在 ELISA plate 上置放
在 4℃過夜。翌日將抗原沖洗乾淨後加上 200μl 1％ BSA-PBS
來當阻斷性溶液，置於室溫2 小時或 4℃過夜。將 1％ BSA-PBS
沖洗乾淨後加入欲測的血清樣本，置於室溫 2小時。再加入 bio
tin-聯結性兔子對抗老鼠 IgG或 IgM抗體，再靜置 2小時。沖洗
乾淨後再加入 avidin-linked peroxidase ，靜置 2小時。最後
加入 ABTS 顯色劑呈色約 30 分鐘，以 5% SDS 停止反應後判讀
其吸光值。
2 OVA-特異性的T細胞增殖反應
將脾臟細胞 2x 106/ml 置於 96-well plate, 再加入 RPMI 培
養基或添加有OVA的培養基。於 37℃ 的 CO2 培養箱兩天後，加
入 1 μCi/well 3H-thymidine，繼續培養 20 小時後，以 cell
harvester 收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後，以閃爍計數儀測3H
-thymidine 含量，以計算細胞增生能力。
3 OVA-特異性的細胞激素製造
將分離出的淋巴球以 2x106/ml 的濃度置於 24-well 的Plate中
，以已知濃度的OVA抗原共同培養來刺激淋巴球。經過 24 到 48
小時的培養後，取上層液以測定其淋巴介質分泌量。淋巴介質的
測定基本上是利用 sandwich-ELISA 法。簡言之，是先利用一個
抗淋巴介質的抗體先覆蓋在 ELISA plate 上，在 4℃ 靜置一晚
。在進行實驗前先以1％ PBS-BSA 處理，再加以清洗。然後將欲
測定之上清液加到 ELISA plate 上，置於室溫兩小時後再加入
biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。室溫靜置 2小時後再加入 avid
in-linked peroxidase，靜置 2小時後，加入受質呈色。
4 遲發性過敏反應 (delayed-type hypersensitivity) 檢測：
先將卵蛋白或是綿羊紅血球 (SRBC) 以皮下注射方式注入小鼠左
後肢，經4 天後測量其足蹼腫脹厚度。再將卵蛋白或是 SRBC 以
皮下注射方式注入小鼠右後肢，經24小時後測量其足蹼腫脹厚度
。比較對照組與實驗組小鼠之足蹼厚度增加數值，作為遲發性過
敏反應之分析依據。
二 人體的臨床試驗：
人體試驗的免疫功能評估，原則上與動物的評估近似，惟進行人體的
臨床試驗之前應經過各醫院的人體試驗委員會通過才能加以進行。
(一) 非特異性免疫反應：
1 周邊血液單核球 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC
) 的反應：
－T 細胞建議使用如 Con A或是 PHA的裂殖素 (mitogen)，或是
利用交叉連結抗CD3 抗體來刺激
－B 細胞建議使用Pokeweed mitogen (PWM) 來刺激
進行步驟：
(1) 3H-thymidine incoroperation 法：
方法較靈敏，將PBMC 2x 106/ml 置於 96-well plate, 再加
入 RPMI 培養基或添加有 LPS (lipopolysaccharide) ,Con A
,PHA, PWM 等細胞裂殖素的培養基。於 37℃ CO2 培養箱兩天
後，加入1 μCi/well 3H-thymidine，繼續培養 20 小時後，
以 cell harvester 收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後以閃爍計
數儀測 3H-thymidine 含量，計算細胞增生能力。
(2) MTT 法：
MTT 的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，
產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞
裂殖素的刺激，增生越多，活的細胞愈多，則酵素的活性就會
較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定
細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確
度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意
。
(3) 螢光流體計數儀來測定DNA 的染色：
利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激，細胞核內的 D
NA 是否有任何變化，可以分別利用 Propidium iodide (PI)
及 bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。PI可以在染色
後直接利用螢光流體計數儀加以分析，但是 BrdU 的方法則需
要再加上一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光，才能利用螢光流
體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的DNA 有增
加的變化，同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用抗 C
D3 及抗 B220 抗體先行染色，再將細胞加以固定，然後進行
DNA 的染色。可以對細胞的表面標記及細胞內的 DNA 螢光使
用不同波長的螢光，以在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分
析。如果能夠達到此一目的，便能夠不需要將細胞分離出就可
以知道是那些細胞受到活化。
2 抗體分泌實驗
血液中免疫球蛋白濃度：目前測定血清內免疫球蛋白的濃度，最
常利用到的方法為 radio immunodiffusion (RID) 法，此種方
法在使用上較為方便，只要將血清放入培養孔中，靜置 24 至 4
8 小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，便可以算出免疫
球蛋白濃度。除此外，也可以利用 sandwich-ELISA ，或是生化
的方法將免疫球蛋白的濃度計算出來，但是生化的方法可能必須
在較具規模的醫學中心才能作得到。
3 細胞激素分泌實驗
將分離出的淋巴球以 2x106/ml 的濃度置於 24-well 的 Plate
中，利用已經定量過的 Con A 或抗 CD3 抗體來刺激這些淋巴球
。經過 24 到 48 小時的培養後，將上層液離心下來，以測定其
淋巴介質製造的量。在取得足夠檢體以前，可將其它檢體先保存
在 -70℃，等到檢體足夠時再一起測試。淋巴介質的測定是利用
sandwich- ELISA 法。先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在
ELISA plate 上，在4℃ 靜置一晚。在進行實驗前先以 1％ PBS
-BSA 處理後清洗之。再將要處理的檢體加到 plate 上，置於
室溫 2小時後加入 biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。兩小時的室
溫靜買後，加入 avidin 聯結過氧化酵素 (avidin-linked pero
xidase) ，再靜置二個小時後加入受質以呈色。上述的裂殖素的
濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其最適當的濃度，並
以已知濃度的淋巴介質作為對照。
4 自然殺手細胞活性
為要測定實驗動物之自然殺手細胞的活性，我們先培養自然殺手
細胞的標的細胞 (K-562 細胞株) 。原則上也是將 K-562細胞與
Cr先在一起培養約 4小時，再將殘餘在試管中而未移除的 Cr
除去。此時再加入不同數目的單核球與已經與 Cr培養過的標的
細胞一起培養，在培養一段時間後取出上清液，放入γ-counter
內計算其放射線強度。在實驗的過程中，利用 NP-40或是 HCl將
細胞破壞，以取得 Cr的最高釋放值。
實驗值－背景值
計算公式＝───────── ×100％
最高釋放值－背景值
5 吞噬細胞活性：
吞噬細胞可以分別測定單核球或是中性白血球的吞噬能力，目前
可以分別利用吞噬細菌如 E. coli、yeast 等方法來加以測定，
也可以利用已標記好的 E. coli (如螢光) ，在細胞吞噬後利用
螢光流體計數儀來加以分析。
6 周邊血液單核球的表面標記分析：
人類的周邊血液單核球的表面標記分析，利用含有sodium citra
te的試管來收集檢體，再利用 FITC 及 PE 染色的單株抗體來計
算不同表面標記的比例及數目。這些細胞表面標記的測定將利用
於 FACS 分析法。
(二) 特異性免疫反應
人體的特異性免疫反應的評估主要是利用疫苗的接種，來評估其反
應。建議的疫苗為破傷風類毒素 (tetanus toxoid, TT) ，由於破
傷風經常使用到，而且得到的結果顯示也可以達到相當理想的免疫
反應，所以可以利用 TT 來進行此類的評估。其他的疫苗也可以加
以考慮，可以配合人體試驗時是否正在注射相關的疫苗來加以考量
。
1 TT誘發的特異性抗體產生
將 100μl 的 10μg/ml TT覆蓋在 ELISA plate上，置放在 4℃
過夜。翌日將抗原沖洗乾淨後加上 200μl 1 ％ BSA-PBS 來當
阻斷性溶液，置於室溫 2小時或 4℃過夜。將 1％ BSA- PBS 沖
洗乾淨後加入欲測的血清樣本，置於室溫 2小時。再加入biotin
- 聯結性兔子對抗人類IgG或 IgM 抗體，再靜置 2小時。沖洗乾
淨後再加入avidin-linked peroxidase，靜置 2小時。最後加入
ABTS 顯色劑呈色約 30 分鐘，以 5％ SDS停止反應後判讀其吸
光值。
2 TT- 特異性的 T細胞增殖反應
將 PBMC 2× 1000000 /ml 置於 96-well plate ，再加入 RPMI
培養基或添加有 OVA的培養基。於 37℃ 的 ＣＯ2培養箱兩天後
，加入 1μCi/well 3Ｈ-thymidine ，繼續培養 20 小時後，以
cell ha rvester 收集細胞於濾紙上，瀘紙風乾後，以閃爍計數
儀測 3Ｈ-thymidine含量，以計算細胞增生能力。
3 TT- 特異性的細胞激素製造
將分離出的淋巴球以 2×1000000 /ml 的濃度置於 24-well 的
Plate 中，以已知濃度的 TT 抗原共同培養來刺激淋巴球。經過
24 到 48 小時的培養後，取上層液以測定其淋巴介質分泌量。
淋巴介質的測定基本上是利用 sandwich-ELISA 法。簡言之，是
先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在 ELISA plate上，在 4℃
靜置一晚。在進行實驗前先以 1％ PBS-BSA處理，再加以清洗。
然後將欲測定之上清液加到 ELISA plate上，置於室溫 2小時後
再入 biotin 聯結的抗淋巴質抗體。室溫靜置 2 小時後再加入
avidin-linked preoxidase，再靜置 2小時後，加入受質呈色。
4 遲發性過敏反應 (delayed-type hypersensitivity, DTH) 檢測
：
人體的延遲性過敏反應是利用已經製成商業製劑的套組來進行，
這些製劑中的常用抗原包括 TT 、白色念珠菌等抗原。要測定這
些抗原的 DTH，係將這些抗原注射入皮內，再分別經過 24 及48
小時，分別記錄皮膚的紅腫直徑範圍。其結果也應該與正常人的
反應作一個比較。
上述的免疫評估是指一般免疫功能的評估，如果要進一步探討如
對病毒感染、過敏疾病、風溼病或是腫瘤的免疫功能，應該另外
建立動物模式或是進行相關的人體臨床試驗來加以評估。
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參 評估方法之原則要求
建議依照上述實驗項目及方法，可以分別針對非特異性及特異免疫功
能的評估而決定其實驗項目。
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肆 結果判定之基準
判定的基準原則上依據上述實驗項目及方法進行相關研究，統計分析
有意義者判定其功能。
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