健康食品安全性評估方法 

(民國 88 年 08 月 02 日修正)

 

 

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壹  前言
    為評估健康食品之安全性,依健康食品管理法第三條第二項規定訂定
    本方法。本方法規定健康食品安全性評估資料及毒性試驗項目及方法
    。
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貳  毒性試驗之規範
一  試驗操作規範
    研發所需進行之非臨床試驗請參考衛生署 87 年 6月 29 日公告之「
    藥品非臨床試驗優良操作規範」進行,並妥善保存所有觀察結果、原
    始數據及文書紀錄,以確保各項試驗數據之品質及試驗之完整性與可
    信度。
二  安全性評估之分類
    健康食品之安全評估分為四個類別,主要係針對以往長期食用及製造
    加工之安全性作考量,故食用目的、方式、製造加工方法、流程、最
    終產品形式及攝食量等均為分類之考慮因素。各類之安全評估項目如
    下:
    第一類:屬下列二種情形之一者,得免再進行毒性測試。
 (一) 產品之原料為傳統食用且以通常加工食品形式供食者。
 (二) 產品具有完整之毒理學安全性學術文獻報告及曾供食用之紀錄,且
      其原料、組成成分及製造過程與所提具之學術文獻報告完全相符者
      。
    第二類:產品之原料為傳統食用而非以通常加工食品形式供食者,應
    檢具下列項目之毒性測試資料。
 (一) 基因毒性試驗
 (二) 28天餵食毒性試驗
    第三類:產品之原料非屬傳統食用者,應檢具下列項目之毒性測試資
    料。
 (一) 基因毒性試驗
 (二) 90天餵食毒性試驗
 (三) 致畸試驗
    第四類:產品之原料非屬傳統食用且含有致癌物之類似物者,應檢具
    下列項目之毒性測試資料。
 (一) 基因毒性試驗
 (二) 90天餵食毒性試驗
 (三) 致畸試驗
 (四) 致癌性試驗
 (五) 繁殖試驗
三  毒性試驗之方法
    毒性試驗之方法包括下列六項:
 (一) 基因毒性試驗 (Genotoxicity study)
      基因毒性試驗可分為體內 (in vivo)  與體外 (in vitro) 測試,
      其目的為偵測試驗物質直接或間接引發的基因傷害及程度。一般基
      因毒性試驗有助於預測試驗物質的致癌性,且有助於致癌性試驗的
      結果分析。
      試驗物質須進行三種以上的基因毒性測試,包括:微生物基因突變
      分析,體外哺乳類細胞基因毒性分析,及動物體內基因毒性分析。
      依試驗物質的性質可增加其他的基因毒性測試 (說明 1) 。
      1 微生物基因突變分析
        一般使用細菌基因突變測試法 (gene mutation in bacteria)。
      (1) 菌株
          需使用下列5種菌株:
          S. typhimurium TA98
          S. typhimurium TA100
          S. typhimurium TA1535
          S. typhimurium TA1537、TA97、 或 TA97a
          S. typhimurium TA102、E. coli WP2 uvr A、 或E. coli
            WP2 uvr A (pKM101)
          註:與所列之三種菌株,分別擇一使用。
      (2) 劑量範圍
          進行五個以上劑量組,最高劑量須足以產生明顯的毒性。毒性
          之產生可由初步試驗中逆突變的菌落 (revertants) 數量的減
          少測得。若試驗物質為高溶解度低毒性物質,最高劑量為 5
          mg/plate,若試驗物質具有明顯的抗菌活性,則以產生抗菌活
          性的劑量作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質,則以產
          生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度,但不超過 5 mg/pl
          ate。
      (3) 對照組
          對照組包含陰性對照組及陽性對照組 (說明2 ) 。
      (4) 代謝活化 (Metabolic activation)
          進行含有及不含有S9混合物的測試 (說明3 ) 。
      (5) 測試方法
          前置培養法 (Preincubation method),或
          平板混合試驗法 (Plate incorporation method)
      (6) 試驗結果
          每盤培養皿中突變菌落的數量,須以各測試點之平均值,再以
          表格方式詳細記錄。
      2 體外哺乳類細胞基因毒性分析
        一般使用體外哺乳類細胞的染色體異常分析法 (In vitro Chrom
        osomal aberration test with mammalian cells in culture)
        或體外鼷鼠淋巴瘤 tk 分析法 (In vitro mouse lymphoma tk
        assay)。
      (1) 體外哺乳類細胞的染色體異常分析法
          細胞
            使用哺乳類細胞株或初代哺乳類細胞。
         劑量範圍
            進行三個以上劑量組,劑量間隔可為 2倍或自然對數對半
             (half-log)。
            依據初步試驗結果決定最高劑量,以試驗物質會造成 50
            %以上之細胞生長抑制的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞
            毒性,則以 5 mg/ml或 10 mM (以較低者為準) 作為最高劑
            量。若試驗物質為低溶解度物質,則以產生最少沈澱物的濃
            度作為測試的最高濃度,但不超過 5 mg/ml或10 mM。
          對照組
            對照組包含陰性對照組及陽性對照組 (說明2 ) 。
          代謝活化
            進行含有及不含有代謝活化系統的測試,如 S9 混合物 (說
            明3 )。
          實驗步驟
            i.細胞在試驗物質處理後之適當時機,製備染色體玻片。
              由於試驗物質可能會造成細胞週期延長,故須在一個適當
              間隔製備檢品。
           ii.每個劑量組製備兩片玻片,每片至少觀察 100個分裂中期
              細胞,檢查染色體結構變異與多套染色體 (polyploid)
              的數目。在描述細胞形態異常時,須註明染色體或染色分
              體的結構變異種類。
          試驗結果
            以表格方式描述染色體變異的種類及數量,並計算含染色體
            結構變異細胞之頻率。
      (2) 體外鼷鼠淋巴瘤 tk 分析法
          細胞
            使用L5178Y TK+/- 鼷鼠淋巴瘤細胞株。
          劑量範圍
            進行三個以上劑量組,劑量間隔可為 2倍或自然對數對半。
            依據初步試驗結果決定最高劑量,以試驗物質會造成 80 %
            以上之細胞死亡的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞毒性,
            則以 5 mg/ml或 10 mM (以較低者為準) 作為最高劑量。若
            試驗物質為低溶解度物質,則以產生最少沈澱物的濃度作為
            測試的最高濃度,但不超過 5 mg/ml或 10 mM。
          對照組
            對照組包含陰性對照組及陽性對照組 (說明 2) 。
          代謝活化
            進行含有及不含有 S9 混合物的測試 (說明 3) 。
          實驗步驟
            i.細胞在試驗物質處理後之適當時機,清洗去除試驗物質後
              ,細胞繼續培養以測定其存活率,同時使細胞表現因試驗
              物質引發之致突變表現型 (mutant phenotype) 。
           ii.細胞經過適當的培養時間 (足以表現引發之致突變表型)
              ,細胞分別培養於含及不含嘧啶類似物培養液中,以測定
              其致突變數量 (numbers of mutants) 及細胞複製之效率
               (cloning efficiency) 。嘧啶類似物如bromodeoxyurid
              ine (BrdU)、fluorodeoxyuridine (FdU)或 trifluoroth
              ymidine (TFT) 等。
          試驗結果
            以表格方式描述每劑量組之細胞突變及存活之數目,同時計
            算細胞之存活率、複製效率及細胞致突變之頻率。
      3 動物活體基因毒性分析
        一般使用囓齒類動物造血細胞的染色體傷害分析法 (In vivo
        test for chromosomal damage using rodent hematopoietic
        cells) 。
      (1) 動物
          一般使用雄性鼷鼠。若雄性與雌性動物在代謝或毒性上有明顯
          的差異時,則須同時使用雄、雌動物進行試驗。若試驗物質為
          特別針對某種性別時,則應使用該性別動物進行試驗。
      (2) 動物數量
          每組至少五隻動物。
      (3) 試驗物質給予途徑
          以腹腔注射或強迫餵食給予。
      (4) 劑量範圍
          測試三個以上劑量組。
          若試驗需要,可由短期試驗之單一 (或重覆) 劑量投予試驗物
          質決定最高容許劑量,最高容許劑量即該劑量可引發骨髓毒性
          或其他明顯之毒性症狀,如抑制體重增加等,一般以最高容許
          劑量作為最高劑量。
      (5) 對照組
          一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組,陽性對照組則給
          予會引發致突變物質。
      (6) 試驗物質給予頻率
          單一或重覆劑量均可。
      (7) 測試方法
          囓齒類骨髓細胞染色體異常測試法 (Chromosomal aberrati
            ons in bone marrow cells of rodents)
          囓齒類骨髓細胞之微核測試法 (Micronuclei in bone marr
            ow cells of rodents)
          囓齒類周邊血液之微核測試法(Micronuclei in peripheral
            blood of rodents)
      (8) 實驗步驟
          囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法
            i.經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲,製備染色體玻片
              。由於試驗物質可能會造成細胞週期延長,故須在一個適
              當間隔製備檢品。
           ii.每個劑量組製備兩片,每片至少觀察 100個分裂中期細胞
              ,檢查染色體結構變異與多套染色體的數目。在描述細胞
              形態異常時,須註明染色體或染色分體的結構變異種類。
          囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法
            i.經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲,並製備骨髓或血
              液抹片。一般動物經試驗物質處理後一段時間 (18到 30
              小時) 即犧牲並收集檢品,或在 24 到 72 小時內進行多
              次採樣製作樣本。若試驗需要,可經由短期預備試驗結果
              ,選擇反應最明顯的時間採樣。
           ii.每隻動物至少觀察1000個多染性紅血球 (polychromatic
              erythrocytes) 或網狀紅血球 (reticulocytes),記錄微
              核發生的數目,同時計算多染性紅血球或網狀紅血球佔全
              部紅血球的比例。
              可採用Giemsa 或 Acridine orange 螢光染劑之染色方法
              。可以觀察網狀紅血球的產生取代多染性紅血球。
      (9) 試驗結果
          囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法
            以表格方式描述染色體變異的細胞總數,或每個細胞變異的
            頻率。
          囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法
            以表格記錄多染性紅血球或網狀紅血球中微核發生的數目,
            及多染性紅血球或網狀紅血球佔全部紅血球的比例。
      說明
      1 基因毒性測試方法有:
      (1) 以基因突變為參考指標的測試方法
          Gene mutation test with bacteria
          Gene mutation test with mammalian cells in culture
          Test with Drosophila melanogaster
          Spot test with mice
          Specific locus test with mice
      (2) 以染色體變異做為參考指標的測試方法
          Chromosomal aberration test with mammalian cells in
            culture
          Chromosomal aberration test with bone marrow cells
            of rodents
          Micronucleus test with rodents
          Chromosomal aberration test with genocytes of rodent
            s
          Dominant lethal test with rodents
          Reciprocal translocation test with mice
      (3) 以基因受損為參考指數的測試
          Phage induction test with bacteria
          DNA repair test with bacteria
          Unscheduled DNA synthesis test (UDS) with mammalian
            cells
          Sister chromatid exchange (SCE) test with mammalian
            cells
      (4) 其他測試
          Mitotic recombination and gene conversion test with
            yeast
          Sperm abnormality test
      2 一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組,而陽性對照組則依
        試驗具代謝活化與否之測試,加入適當的致突變劑 (mutagens)
        。
      3 使用 S9 混合物 (S9及coenzymes 等) S9  製備方法為哺乳類動
        物 (鼠) 經藥物誘發代謝酵素處理後,自其肝臟萃取並經 9000
        Xg離心而得的肝臟酵素 。
 (二) 28天餵食毒性試驗 (28-day feeding toxicity study)
      28天餵食毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆給予28天後對哺乳
      類動物可能產生之毒性影響,了解毒性變化之產生,同時測定無毒
      性顯示之劑量 (no-observed-adverse-effect level, NOAEL)。
      1 動物品種及性別
        囓齒類,最常使用的動物為鼠,雄、雌兩性動物的數量須相同,
        給予試驗物質之週齡為 5-6 週。
      2 動物數量
        每個劑量組使用雄、雌至少各10隻動物;若須進行試驗中期解剖
        或復原測試,動物數量須視解剖的次數適量增加。試驗終結需有
        足夠數量存活之動物以進行適當之毒性評估。
      3 試驗物質給予途徑
        一般採用胃管經口餵食 (gavage) ,必要時得混入飼料或飲水中
        。
        採用胃管經口餵食時之餵食體積應在 10 ml/kg 動物體重以下,
        若餵食體積過高,可採多次餵食方式,但須在 6小時內完成。
      4 試驗物質給予期間
        每天固定時間給予試驗物質,連續 28 天。
      5 劑量範圍
        為使毒性試驗能夠顯示試驗物質的毒性影響,了解劑量與毒性間
        的關係,並預估無毒性顯示之劑量 (NOAEL)。試驗中至少要有三
        個劑量組:(1) 高劑量為該劑量足以使試驗動物產生毒性症狀,
        但不造成死亡;(2) 低劑量為不會引起毒性的劑量;(3) 中間劑
        量為足以引起最低毒性作用 (如血中酵素值改變或體重成長速度
        下降) 。此外,還要包括載體對照組或空白對照組,若試驗需要
        可加入參考對照組。劑量選擇之依據應加以說明。
        若試驗物質混入飼料或飲水中,則濃度不得超過 5% (w/w)  。
        當以胃管強迫餵食,若在技術上可給予之最大劑量 (但不得超過
        1000 mg/kg) ,而未顯現任何毒性徵兆,則以此劑量做為最高劑
        量。
      6 觀察與檢驗
      (1) 臨床觀察
          每天觀察動物至少二次(兩次時間間隔不得少於六小時),以
            確定死亡情形。
          每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上,記錄試驗動物顯示
            的毒性作用,包括作用之開始及過程。
      (2) 體重與食物消耗量
          定期測量動物的體重及食物消耗量。
          體重:試驗開始給予試驗物質前,測量動物體重;試驗期間
            每週至少測量一次。
          食物消耗量:試驗開始給予試驗物質前,測量食物消耗量;
            試驗期間每週至少測量一次。食物消耗量之測量可以每隻或
            每組為單位。
            若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給予,則須以每隻
            或每組為單位,定期測量飲食或飲水的消耗量,同時測量食
            物的掉落量,換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前
            及在適當時機進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量
            。
      (3) 臨床病理檢驗
          血液檢驗 (Hematology)
            試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血液檢驗,一般而言,
            全部動物均須進行血液檢驗,但可因實際情形考量,囓齒類
            動物每個劑量組至少選擇雄、雌各10隻動物進行檢測。血液
            檢驗項目應包括:hematocrit 、hemoglobin、erythrocyte
            count、total and differential leukocyte counts及凝血
            因子 (例如clotting time、prothrombin time、activated
            partial thromboplastin time 或 platelet count)等之測
            量。視試驗需要而定。
          血清生化檢驗 (Clinical Chemistry)
            試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血清生化檢驗。一般而
            言,全部動物均須進行血清生化檢驗,但可因實際情形考量
            ,每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動物進行檢測。血清
            生化檢驗內容應包括電解質的平衡、醣類的代謝、及肝與腎
            功能等。
            血清生化檢測項目包含 alkaline phosphatase、alanine
            aminotransferase、aspartate aminotransferase、gamma-
            glutamyl transferase、albumin、bilirubin (total)、
            creatinine、urea nitrogen、Bglucose、phosphorus 、
            calcium、chloride、potassium、sodium、protein (total
            ) 等。
          尿液檢驗 (Urinalysis)
            視試驗需要進行。每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動物
            ,在試驗物質給予前後進行尿液檢驗一次以上。
            尿液檢驗項目:顯微鏡觀察尿沈渣,測量尿液之量、酸鹼值
            與比重,並測量尿液中之 protein、glucose、ketones Bbi
            lirubin 與 occult blood 等的含量。
          眼睛檢查 (Ophthalmological examination)
            眼睛檢驗包括肉眼檢驗與鏡檢眼睛的外部及內部構造。最高
            劑量組及對照組的動物在試驗開始給予試驗物質前及試驗結
            束時進行眼睛檢查一次以上。若發現眼睛異常,則全部動物
            均須進行眼睛檢查。
      (4) 組織病理檢驗
          試驗期間死亡的動物須儘快進行解剖,肉眼檢查器官與組織
            之變化。若許可,主要臟器分別稱重並進行組織病理檢查,
            以尋求死亡的原因及毒性變化的性質 (如嚴重程度) 。
          為獲得更充足的毒性資料,垂死的動物均行安樂死。動物在
            犧牲之前須記錄臨床觀察之結果,若許可,收集血液樣品以
            進行血液及血清生化分析。動物進行屍體解剖,以肉眼觀察
            其器官與組織,並進行組織病理檢驗,以了解毒性變化的性
            質 (嚴重程度) ,若試驗需要,記錄主要臟器的重量。
          試驗 (試驗物質給予期間) 結束,全部存活的動物行安樂死
            後,在剖檢前先收集血液樣品,以進行血液與血清生化分析
            。屍體解剖時,肉眼觀察及記錄動物的器官與組織之變化,
            並測量主要臟器重量。最高劑量組與對照組須進行組織病理
            檢驗,若最高劑量組中某種器官及/或組織發現病變現象,
            則全部動物的該器官及/或組織,及其他劑量組中發現任何
            組織病變,均應進行組織病理檢驗。
          一般器官與組織的組織病理檢驗及稱重之項目如下,但可依
            試驗性質之特性及肉眼檢查發現之異常變化而有所增減:
          i.臟器稱重:liver、adrenals、kidneys、gonad 等分別稱重
            。
         ii.組織病理檢驗:adrenals、heart、kidneys、liver、splee
            n 、及目標器官。
 (三) 90天餵食毒性試驗 (90-day feeding toxicity study)
      90天毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆餵食 90 天後對哺乳類
      動物可能產生之毒性影響,且提供更長期試驗劑量設定之依據。
      一般而言,試驗之期間為三個月,在試驗前須先進行一個月的短期
      重覆劑量毒性試驗。此短期試驗可為長期毒性試驗決定適當的劑量
      範圍,同時可了解該試驗物質的早期毒性變化,再配合長期毒性試
      驗的結果,則可了解該試驗物質的毒性影響。
      1 動物品種及性別
        囓齒類,最常使用的動物為鼠,雄、雌兩性動物的數量須相同,
        給予試驗物質之週齡為 5-6 週。
      2 動物數量
        每個劑量組使用雄、雌至少各 10 隻動物。若須進行試驗中期解
        剖或復原測試,動物數量須視解剖的次數適量增加。試驗終結需
        有足夠數量存活之動物以進行適當之毒性評估。
      3 試驗物質給予途徑
        一般採用胃管經口餵食 (gavage) ,必要時得混入飼料或飲水中
        。
        採用胃管經口餵食時之餵食體積應在 10 ml/kg 動物體重以下,
        若餵食體積過大,可採多次餵食方式,但須在 6小時內完成。
      4 試驗物質給予期間
        每天固定時間給予試驗物質,連續 90 天。
      5 劑量範圍
        參考 (二)  5.28 天餵食毒性試驗之劑量範圍。
      6 觀察與檢驗
      (1) 臨床觀察
          每天觀察動物至少二次,以確定死亡情形。
          每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上,記錄試驗動物顯示
            的毒性作用,包括作用之開始及過程。若發現腫瘤生長,則
            記錄每個肉眼可觀察到或觸摸到的腫瘤發現時間、部位、大
            小、外觀及成長過程。並同時觀察動物行為的改變、自主官
            能管制失調、及其他神經系統毒性徵象。
      (2) 體重與食物消耗量
          定期測量動物的體重及食物消耗量。
          體重:試驗開始給予試驗物質前,測量動物體重;試驗期間
            每週至少測量一次。
          食物消耗量:試驗開始給予試驗物質前,測量食物消耗量;
            試驗期間每週至少測量一次。食物消耗量之測量可以每隻或
            每組為單位。
            若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給予,則須以每隻
            或每組為單位,定期測量飲食或飲水的消耗量,同時測量食
            物的掉落量,換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前
            及在適當時機進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量
            。
      (3) 臨床病理檢驗
          血液檢驗 (Hematology)
            試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血液檢驗,一般而言,
            全部動物均須進行血液檢驗,但可因實際情形考量,囓齒類
            動物每個劑量組至少選擇雄、雌各 10 隻動物進行檢測。血
            液檢驗項目應包括:hematocrit、hemoglobin、erythrocyt
            e count、total and differential leukocyte counts及凝
            血因子 (例如 clotting time、prothrombin time、activa
            ted partial thromboplastin time 或 platelet count)等
            之測量。視試驗需要而定。
          血清生化檢驗 (Clinical Chemistry)
            試驗動物須在試驗結束前採樣以進行以進行血清生化檢驗,
            一般而言,全部動物均須進行血清生化檢驗,但可因實際情
            形考量,每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動物進行檢測
            。血清生化檢驗內容應包括電解質的平衡、醣類的代謝、及
            肝與腎功能等。
            i.血清生化檢測項目包含 alkaline phosphatase、alanine
              aminotransferase、aspartate aminotransferase、gamm
              a-glutamyl transferase、albumin、bilirubin (total)
              、creatinine、urea nitrogen、glucose、phosphorus、
              calcium、chloride、potassium、sodium、protein (tot
              al) 等。
           ii.若需更深入研究試驗物質之毒性機轉,其他生化分析方法
              可視試驗物質之特性及試驗需要列入,如 acid/base bal
              ance、cholinesterases、hormones、lipids、methemogl
              obin  等項目。
          尿液檢驗 (Urinalysis)
            視試驗需要進行。每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動物
            ,在試驗物質給予期間進行尿液檢驗一次以上。
            尿液檢驗項目:顯微鏡觀察尿沈渣,測量尿液之量、酸鹼值
            與比重,並測量尿液中之 protein Bglucose Bketones Bbi
            lirubin 與 occult blood 等的含量。
          眼睛檢查 (Ophthalmological examination)
            眼睛檢驗包括肉眼檢驗與鏡檢眼睛的外部及內部構造。最高
            劑量組及對照組的動物在試驗開始給予試驗物質前及試驗結
            束時進行眼睛檢查一次以上。若發現眼睛的改變是因試驗物
            質引起,則全部動物均須進行眼睛檢查。
      (4) 組織病理檢驗
          試驗期間死亡的動物須儘快進行解剖,肉眼檢查器官與組織
            之變化。若許可,主要臟器分別稱重並進行組織病理檢查,
            以找出死亡的原因及毒性變化的性質 (如嚴重程度) 。
          為獲得更充足的毒性資料,垂死的動物均行安樂死。動物在
            犧牲之前須記錄臨床觀察之結果,若許可,收集血液樣品以
            進行血液及血清生化分析。動物進行屍體解剖,以肉眼觀察
            其器官與組織,並進行組織病理檢驗,以了解毒性變化的性
            質 (嚴重程度) ,若試驗需要,記錄主要臟器的重量。
          試驗 (試驗物質給予期或復原期) 結束,全部存活的動物行
            安樂死後,在剖檢前先收集血液樣品,以進行血液與血清生
            化分析。屍體解剖時,肉眼觀察及記錄動物的器官與組織之
            變化,並測量主要臟器重量。囓齒類動物之最高劑量組與對
            照組須進行組織病理檢驗,若最高劑量組中某種器官及/或
            組織發現病變現象,則全部動物的該器官及/或組織,及其
            他劑量組中發現任何組織變化的組織,均應進行組織病理檢
            驗。
          一般器官與組織的組織病理檢驗及稱重之項目如下,但可依
            試驗性質之特性及肉眼檢查發現之異常變化而有所增減:
            i.臟器稱重:liver、brain、heart、adrenals、kidneys、
              及gonads等分別稱重。
           ii.組織病理檢驗:adrenals、aorta、bone (sternum/femur
              )*、bone marrow (sternum/femur)、brain (at least 3
              different levels) 、small intestine (duodenum 、
              ileum 、jejunum) 、large intestine (caecum 、colon
              、rectum)、 esophagus、 eye(s)*、 female mammary
              gland*、Harderian gland* 、heart 、kidneys 、liver
              、trachea and lung(s)、lymph nodes (representative
              ) 、ovaries/testes 、pancreas 、peripheral nerve、
              pituitary 、 prostate 、 salivary gland*、 skin*、
              spinal cord (at least 2 different locations)、sple
              en 、stomach thingh musculature* thymus (or thymic
              region) 、thyroid/parathyroids 、urinary bladder
              、uterus 、accessory genital organs* and tissues
              showing gross lesions 。
           *視試驗需要才進行。
 (四) 致畸試驗 (Teratogenicity)
      致畸試驗係測試試驗物質對胚胎發育之影響、及造成畸胎之可能性
      ,試驗物質給予週期為自胚胎著床至器官形成完全之階段,此階段
      為器官形成期。
      1 動物品種
        鼠、鼷鼠或兔子。
      2 動物數量
        若以鼠、鼷鼠進行試驗,每劑量組 20 隻動物以上,兔子則 12
        隻以上 (說明 1) 。
      3 試驗物質給予途徑
        採用胃管口服給予 (gavage) ,必要時得混入飼料或飲水中 (說
        明 2) 。
      4 劑量範圍
        進行三個以上劑量組 (說明 3) ,及陰性對照組。視試驗需要可
        加入陽性對照組或參考性對照組 (說明 4) 。
      5 試驗物質給予途徑週期
        在器官形成期間每天餵食。鼠、鼷鼠自懷孕的第 6天到第 15 天
        ;兔子自懷孕的第 6天到第 18 天。
      6 實驗步驟
      (1) 試驗期間:
          臨床觀察:每天觀察一次以上並記錄動物的死亡率、臨床症狀
          。
          動物體重:每週測量動物體重至少二次 。
          食物消耗量:每週測量食物消耗量至少一次 。
      (2) 在分娩前一天 (鼠在懷孕第 20 天,兔子則在懷孕第 29 天)
          全部雌性動物進行解剖,檢測其懷孕成功率、胎兒的死亡率、
          黃體數目等。存活的胎兒則進行體重測量並檢驗其外觀 (說明
          5),同時肉眼觀察雌性動物的器官與組織 (說明 6) 。若發現
          任何組織變化,保存其器官及對照組的相對器官,若試驗需要
          ,可進行組織病理檢驗。
      (3) 若為鼠/鼷鼠試驗,最高劑量組及對照組之雌性動物,每一胎
          中 1/2 的新生兒進行骨骼檢查,另 1/2 的新生兒進行內臟組
          織檢查,若最高劑量組發現異常現象,則全部動物均須進行組
          織與骨骼檢查。而兔子試驗則全部新生兒進行組織與骨骼檢查
          。
      說明
      1 此處的動物數目是指懷孕成功的雌性動物。
      2 口服給予試驗物質可以強迫餵食、混入飼料或溶於飲用水中進食
        方式進行,但強迫餵食的方式較佳,因投予試驗物質量準確,但
        給予之體積應在 10 ml/kg 動物體重以下,若給予體積過大,可
        採多次給予方式,但須在 6小時內完成。
      3 (1) 如有可能,最高劑量要能造成毒性症狀,如飲食量減低、體
            重增加、受到抑制或改變臨床病理參數。若試驗物質沒有顯
            示出毒性時,則以技術上可給予的最高劑量作為最高劑量。
            最低劑量則以對雌性動物或胚胎不產生不良影響之劑量,而
            中間劑量則取最高劑量與最低劑量之幾何平均值。
        (2) 劑量之選擇最好包括在動物活體中會產生功能的有效劑量。
      4 若給予試驗物質時,須使用媒介物或乳化劑,陰性對照組的動物
        則給予該媒介物或乳化劑。陽性對照組的動物一般給予會產生生
        殖毒性的物質,而參考性對照組動物則給予和試驗物質的化學結
        構或藥效類似的藥物。
      5 在懷孕後期仍存活的胎兒,須檢查其性別及體內、外之器官與組
        織的變化。骨骼與成骨經透明及染色處理製作成骨骼標本,以觀
        察其內部骨骼形態變化。若試驗需要,可進一步作組織或組織化
        學檢驗。
 (五) 致癌性試驗(carcinogenicity study)
      根據動物對感染性疾病的抵抗力、動物的生命期、先天性腫瘤自然
      發生率及動物對致癌性物質的敏感度,選擇適當的試驗動物品種,
      初步及長期致癌性試驗須使用相同的動物品種。
      1 初步致癌性試驗
        本試驗的目的是決定長期致癌性試驗的劑量範圍,若已有充足的
        有效數據,則以下試驗可部分或全部刪除:
      (1) 單一劑量毒性試驗
          此試驗的目的是以少量的動物決定重覆劑量毒性試驗的最高劑
          量,詳細試驗方法可參閱本節末之口服急性毒性試驗方法。
      (2) 重覆劑量毒性試驗
          此試驗的目的是決定長期致癌性試驗的最高劑量,詳細試驗方
          法可參考 (三) 90天餵食毒性試驗方法。
          動物品種
            使用兩種以上囓齒類動物,雄、雌兩性並用 (說明 2)。
          動物數量
            每個劑量組使用雄、雌動物各 10 隻或以上。
          試驗物質給予途徑
            口服給予 (說明3)。
          劑量範圍
            每個性別進行3個以上劑量組及對照組(說明4、5)。
          試驗物質給予週期
            給予試驗物質連續三個月以上,每週給予 7天 (說明 6) 。
            若試驗動物具遲發毒性或累積效應的特性,則須延長給予的
            時間。
          試驗步驟
          i.每天觀察動物二次以上,以確定死亡情形。
         ii.每天觀察與記錄所有動物的臨床症狀一次以上。
        iii.每週測量體重一次以上。
         iv.試驗期間死亡或在試驗終結行安樂死的動物均應解剖,並以
            肉眼檢查器官與組織之變化,發生病變之器官及組織須進行
            組織病理檢查。
          試驗結果
          i.估算最高容許劑量(Maximum Tolerated Dose, MTD) (說明7
            ) ,而 MTD值之決定,依據初步致癌性試驗中,該劑量可抑
            制動物體重成長速率 (與對照組比較) 下降 10% 以內,但
            不會造成動物死亡,或器官重量、血液檢驗、尿液檢驗、臨
            床生化檢驗等參數改變,而且肉眼觀察或組織病理亦無明顯
            變化。
         ii.最高劑量須依動物性別與品種加以決定。
      2 長期致癌性試驗
      (1) 動物品種
          使用兩種以上的囓齒類動物,雄、雌兩性並用 (說明 2) 。
      (2) 動物數量
          每組使用雄、雌動物各 50 隻或以上。若須進行試驗中期解剖
          ,動物數量須視解剖的次數適量增加,而每次試驗中期解剖,
          每組雄、雌各 10 隻或以上。動物的分組應以動物體重分類,
          再以適當的隨機取樣方法分配。
      (3) 試驗物質給予途徑
          口服給予 (說明 3) 。
      (4) 劑量範圍
          每個性別進行 3個以上劑量組及對照組,依據初步致癌性試驗
          重覆劑量毒性試驗再決定致癌性試驗的劑量範圍。
          高劑量:以最高容許劑量 (MTD) (說明 7) 、試驗物質及其
            代謝物在囓齒類動物與人體之血液濃度之比值 Area under
            the blood concentration curve (AUC) 25  倍 (說明 8)
            、功能作用 (說明 9) 試驗物質之吸收飽和量 (說明10) 或
            最高可給予之劑量 (說明11) 為高劑量。若試驗物質為非基
            因毒性物質,且以上之高劑量選擇準則均不適用時,其高劑
            量可設定為 1000mg/kg/day,若在人體則使用量為 50mg/kg
            /day (說明12) 。
          中間劑量:依據該試驗物質之藥動參數決定 (說明13)。
          低劑量:以不影響動物之生長、發育及生命期,且不產生任
            何毒性之劑量,一般低劑量不少於高劑量的10% (說明14)
            。
          第 4劑量(視試驗需要進行):若試驗物質投予高劑量與低劑
            量時,其藥動或代謝之性質有顯著差異,則應進行第 4劑量
            組,此劑量是最高劑量能產生與低劑量相同之藥動或代謝性
            質。
      (5) 對照組
          必要進行陰性對照組。
          若試驗物質給予時需使用媒介物或乳化劑,則給予陰性對照
            組的動物該媒介物乳化劑。若試驗需要,也可同時進行空白
            對照組。
      (6) 試驗物質給予週期
          以鼠進行試驗,給予期為 24 個月,而鼷鼠與倉鼠則為 18 個
          月,每週給予 7天 (說明 6) 。
      (7) 試驗期間
          試驗在完成給予試驗物質後或給予後的 1-3 個月結束。若以
          鼠進行試驗,則試驗期最長為 30 個月,鼷鼠或倉鼠則為 24
          個月 (說明15、16) 。
      (8) 觀察與檢驗
          臨床觀察
            i.每天觀察動物至少二次,以確定死亡情形。
           ii.每天觀察與記錄試驗動物的臨床症狀至少一次,記錄包括
              每天肉眼可觀察到或觸摸到的腫瘤發現時間、部位、大小
              、外觀及成長過程。
          體重與食物消耗量
            定期測量動物的體重及食物消耗量。若試驗需要,須同時測
            量動物的飲水消耗量。
            i.體重:開始給予試驗物質前,測量動物體重;給予試驗物
              質期間每週至少測量一次。
           ii.食物消耗量:開始給予試驗物質前,測量食物消耗量;給
              予受試驗物質期間每週至少測量一次 (說明 5) 。
          臨床病理檢驗
            i.血球檢驗 (Hematology)
              動物須在試驗開始投藥前、投藥期間 (3、6、12 與 18個
              月) 及解剖前各採樣一次,以進行血球檢驗 (說明17) 。
           ii.血清生化檢驗 (Clinical chemistry)
              每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動物,須在試驗開始
              給予前、給予期間 (3、6、12與 18 個月) 及解剖前各採
              血一次,以進行血清生化檢驗 (說明 18) 。
          iii.尿液檢驗(Urinalysis)
              視試驗需要進行。每個劑量組選擇雄、雌至少各 10 隻動
              物,在試驗開始給予前、給予期間 (3、6、12與 18 個月
              ) 及試驗結束前進行尿液檢驗 (說明19) 。
          眼睛檢查 (Ophthalmological examination)
            全部動物在試驗開始及試驗結束時進行眼睛檢查一次以上 (
            說明20) 。
          組織病理檢驗 (說明21)
            i.試驗期間死亡的動物須儘快進行解剖,肉眼檢查器官與組
              織之變化。若許可,主要臟器分別稱重並進行組織病理檢
              查,以找出死亡的原因及了解所有試驗物質引發的變化與
              損傷。
           ii.為獲得更充足的毒性資訊,垂死的動物均行安樂死。動物
              在犧牲之前須記錄臨床觀察之結果,若許可,收集血液樣
              品以進行血球及血清生化分析,了解血液有無呈現異常的
              現象,如貧血及淋巴結、肝、脾臟腫大所造成的影響。動
              物進行解剖,以肉眼觀察其器官與組織,並進行組織病理
              檢驗,以了解所有試驗物質所引發的變化與損傷,若試驗
              需要,記錄主要臟器的重量。
          iii.試驗結束 (給予受試物期或復原期) ,全部存活的動物行
              安樂死後,在剖檢前先收集血液樣品,以進行血球與血清
              生化分析,了解血清有呈現異常的現,如貧血及淋巴結、
              肝、脾臟腫大所造成的影響。解剖時,肉眼觀察及記錄動
              物的器官與組織之變化,並測量主要臟器重量。最高劑量
              組與對照組須進行組織病理檢驗,若最高劑量組與對照組
              的病理檢驗發現不同的增生損傷,則所有的動物都要進行
              組織病理檢驗,有助於數據的評估。
      說明:
      1 試驗最好採用藥物代謝形態與人體相似的動物,一般最常使用鼷
        鼠、鼠和倉鼠。試驗開始之時機為動物在 6-8 週齡。
      2 口服給予試驗物質可以強迫餵食、或混入飼料或飲用水中以進食
        方式進行。
      3 每個劑量組的劑量相差 2到 3倍。最高劑量須能引發毒性變化,
        若試驗物質沒有顯示出明顯的毒性變化時,則以技術上可給予最
        高劑量作為最高劑量。
      4 若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給予,則須以每隻或每
        組為單位,定期測量飲食或飲水的消耗量,同時測量食物的掉落
        量,換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前及在適當時機
        進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量。
      5 若以強迫餵食試驗物質,每週至少餵食 5天。
      6 由重覆劑量毒性試驗結果決定最高容許劑量 (MTD)。MTD 是指此
        劑量若使用於慢性毒性試驗為最高劑量時,不會減少動物的壽命
        ,除腫瘤之誘導外不會引起任何毒性反應。而預估 MTD值一般依
        據體重、器官重量、血液檢驗、尿液檢驗、血清生化檢驗等參數
        ,肉眼觀察或組織病理變化等改變而訂定。
      7 由藥動試驗結果決定致癌性試驗之最高容許劑量,只適用非致突
        變性試驗物質,且人體及囓齒類動物之代謝情況相似,同時對囓
        齒類動物為低器官毒性。依據動物與人體之 AUC比較選擇最高劑
        量之準則:
      (1) 藥動試驗與致癌性試驗使用相同的動物品種、投藥途徑及劑量
          範圍,以獲得有效藥動數據。
      (2) 藥動試驗的試驗期要夠長,在選擇藥量範圍之試驗中能觀察與
          藥動時間參數改變之關係。
      (3) 在評估試驗結果時,要以科學判斷決定 AUC之比較是基於試驗
          物質本身、測試物質與其代謝產物、或代謝物的數據。
      (4) 在估計人體與動物之相對血中濃度時,應考慮人體與動物間對
          試驗物質與蛋白質結合之差異。
      (5) 人體的藥動數據要由人體建議每日最高食用量試驗測得。
      8 若以功能效應終點選擇最高劑量,須依每個試驗物質的特性而不
        同。最高劑量為此劑量試驗物質在動物身上產生的功能效應已達
        到最高程度,同時該劑量不會干擾動物之生理或原穩定狀態,不
        會影響到試驗結果的有效度,如引發高血壓及抑制血液凝結等。
      9 若以吸收的飽和程度選擇最高劑量,則低劑量應以代謝及排除途
        徑的飽和程度而選擇。
     10 若試驗動物是以混合飲食方式給予試驗物質,則最高可進食量為
        飲食量的 5%。
     11 若人體使用試驗物質量為 50mg/day  (人體體重為 50 kg,即 1
        mg/kg/day),其高劑量則設定為 1000 mg/kg/day ,計算方法依
        據 mg/kg轉換至 mg/m2、25倍 AUC、及乘以 6 (由 mg/m2  估算
        AUC 可能產生之誤差值) 。
     12 致癌性之中低劑量之選擇應考慮下列各項因素:
     (1) 藥動的線性狀況與代謝途徑的飽和狀態。
     (2) 人體接受試驗物質與實際獲得功能的劑量。
     (3) 正常囓齒類動物之生理狀態的改變。
     (4) 囓齒類動物的功能反應。
     (5) 反應機制及可能產生效用之起始劑量。
     (6) 在短期試驗中觀察到之不可預測性的毒性。
     13 一般最低劑量須大於最高劑量的十分之一,但若最低劑量與人類
        食用的劑量相差甚遠,則亦可小於最高劑量的十分之一。
     14 試驗結束時,非腫瘤導致的動物死亡率應低於 50 %。
     15 因動物死亡引起組織自體溶解或動物飼養問題引起的動物死亡每
        組不得超過 10% 。在試驗期間,若試驗動物出現衰弱或垂死的
        現象,應將動物隔離或行安樂死進行解剖。
     16 血液檢驗項目:參考 (三) 90  天餵食毒性試驗說明 (3)  血
        液檢驗。
     17 血清生化檢測項目:參考 (三) 90  天餵食毒性試驗說明 (3)
        血清生化檢驗。
     18 尿液檢驗項目:參考 (三) 90天餵食毒性試驗說明 (3)  尿液
        檢驗。
     19 眼睛檢驗:參考 (三) 90  天餵食毒性試驗說明 (3)  眼睛檢
        驗。
     20 組織病理檢驗項目:參考 (三) 90  天餵食毒性試驗說明 (4)
        組織病理檢驗。
    ◎口服急性毒性試驗 (Acute oral LD50 study)
      單一劑量口服急性毒性試驗的目的為測試試驗物質經單一劑量餵食
      試驗物質後 (包含 24 小時內完成的多次餵食) ,對哺乳類動物之
      急性毒性影響,包括檢測其在體內毒理特性之量與質的任何改變,
      此試驗結果有助於重覆劑量毒性試驗時劑量範圍之選擇,同時可顯
      示該試驗物質的目標器官與遲發之毒性,並了解餵食試驗物質過量
      可能引發之急性毒性。
      1 動物品種及性別
        常用鼠或鼷鼠之囓齒類,須包括雄、雌兩性,雄、雌性動物的數
        量須相同,動物給予試驗物質之週齡為 5-6 週 (說明 1) 。
      2 動物數量
        囓齒類動物每劑量組使用至少 10 隻 ( 5  雄、 5  雌) 之動物
        。
      3 試驗物質給予途徑
        一般採用胃管經口餵食 (gavage) ,一次餵食 (說明 2) 。
      4 劑量範圍
        劑量範圍須包含不會產生不良作用及足以顯示毒性症狀 (造成死
        亡) 之劑量。此外,還要包括溶劑對照組、及/或空白對照組。
        若試驗物質毒性很低,則以試驗物質技術上可給予之最大劑量進
        行測試或進行急性極限測試 (說明 3) 。
      5 觀察
      (1) 一般試驗觀察期為 14 天,每天觀察動物至少二次,以確定死
          亡情形。
      (2) 每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上,記錄試驗動物顯示的
          毒性症狀,包括死亡率、臨床毒性症狀 (嚴重程度) 、發生時
          間、持續的時間及中毒後的復原性,並瞭解毒性症狀與劑量及
          時間的關係。
      (3) 在觀察期間死亡的動物及試驗終結存活的動物均須進行解剖和
          肉眼病理檢查。
      (4) 若試驗需要,所有肉眼可觀察到有病變的器官與組織均須進行
          組織病理檢驗。
      說明:
      1 若具有初步單一劑量毒性試驗或短期重覆劑量毒性試驗的試驗結
        果,且其劑量範圍及臨床觀察已被確定,則可刪除非囓齒類動物
        的單一劑量毒性認驗。
      2 囓齒類動物,口服給予試驗物質若採強迫餵食方式,餵食前動物
        須經過特定時段的禁食,而餵食之體積應在 10ml/kg  動物體重
        以下,若餵食體積過大,可採多次餵食方式,但須在 24 小時內
        完成。
      3 若試驗許可,依不同劑量所產生的死亡率或毒性症狀估算致死劑
        量。急性極限測試 (Acute limit test) 採取口服一次給予試驗
        物質 5 g/kg 動物體重。
 (六) 繁殖試驗 (Reproduction study)
      繁殖試驗係測試試驗物質對雄、雌兩性的生殖力影響及研究受精卵
      之運送與著床,其試驗物質給予時期分別在懷孕前與懷孕初期。
      1 試驗動物
        一般最常使用鼠或鼷鼠,包含雄、雌兩性。自致畸試驗使用的動
        物中,選擇本試驗的動物品種。
      2 動物數量
        若以鼠或鼷鼠進行試驗,每劑量組使用 40 隻 ( 20 雄、 20 雌
        ) 動物以上。
      3 試驗物質給予途徑
        採用胃管口服給予試驗物質,必要時得混入飼料或飲水中。
      4 劑量範圍
        進行三個以上劑量組 (說明 1) 及陰性對照組。視試驗需要可加
        入陽性對照組或參考性對照組 (說明 2) 。
      5 試驗物質給予週期
        若以鼠或鼷鼠進行試驗, 5-6 週大之雄鼠先行給予試驗物質 6
        0 天以上,然後進行交配,交配期間持續每天給予試驗物質,直
        到交配成功至犧牲雄鼠為止 (說明 3) 。成熟的母鼠則在交配前
        2 週、交配期間、交配成功至胎兒器官開始形成的期間 (自懷孕
        的第 0 天到第 6 天) 每天給予試驗物質。
      6 實驗步驟
      (1) 試驗期間:
          臨床觀察:每天觀察一次以上並記錄動物的死亡率、臨床症狀
          及行為改變。
          動物體重:每週測量動物體重一次以上。
          食物消耗量:每週測量食物消耗量至少一次 (交配期間除外)
          。
      (2) 交配期間,經試驗物質處理的雄鼠與雌鼠以 1:1  方式分配,
          共同居住於一飼養籠中,每天觀察陰道栓塞或進行陰道抹片以
          確定其是否交配成功 (說明 4) ,交配期一般為兩星期。
      (3) 若試驗需要,可將經試驗物質處理的雄鼠與未處理的雌鼠 (或
          反之亦然) 共同居住於一飼養籠中,每天觀察陰道栓塞或進行
          陰道抹片以確定其是否交配成功 (說明 4) 。
      (4) 交配成功的雌鼠在試驗終結時 (懷孕的第 20 天) 進行解剖,
          檢查黃體數目、胚胎的著床與被吸收數目、胚胎死亡率等,並
          進行器官與組織的肉眼觀察,若發現任何組織變化,保存其器
          官及對照組的相對器官,若試驗需要可進行組織病理檢驗。
      (5) 全部動物之睪丸、副睪、卵巢及子宮分別保存,若試驗需要可
          進行組織病理檢驗。
      (6) 用以交配的雄鼠與交配不成功的雌鼠在適當時間須進行解剖,
          肉眼觀察其器官與組織。
      說明
      1 如有可能,最高劑量要能造成毒性症狀,如飲食量減低、體重增
        加受到抑制或改變臨床病理參數。若試驗物質沒有顯示出毒性時
        ,則以技術上可給予的最高劑量作為最高劑量。最低劑量則以對
        雌性動物或胚胎不產生不良影響之劑量,而中間劑量則取最高劑
        量與最低劑量之幾何平均值。
      2 若試驗物質給予時須使用媒介物或乳化劑,陰性對照組的動物則
        給予該媒介物或乳化劑。陽性對照組的動物一般給予會產生生殖
        毒性的物質,而參考性對照組動物則給予和試驗物質的化學結構
        或藥效類似的藥物。
      3 若由重覆劑量毒性試驗 (4 週以上) 之試驗結果顯示該試驗物質
        對精子生成並無任何影響,包括檢查雄、雌性動物之生殖器官的
        重量及組織病理均無異常,雄鼠交配前的試驗物質給予週期可改
        為 4  週。
      4 計算交配指數 (Mating Index) 與生育力指數 (Fertility Inde
        x)  之公式如下:
        交配指數= (交配成功的動物數目/動物同居的數目) ×100
        生育力指數= (雌性動物懷孕的數目/交配成功的雌性動物數目
        ) ×100

 

 

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