健康食品之免疫調節功能評估方法 

(民國 88 年 08 月 02 日修正)

 

   1    
壹  前言
    健康食品的免疫調節功能評估,是針對包括非特異性及特異性免疫功
    能之評估。所調非特異性免疫力主要包括如中性白血球 (neutrophil
    s)及單核球 (monocytes)的吞噬能力或是自然殺手細胞的活性 (natu
    ral killer activity)  。而特異性免疫力主要是針對一些特定的抗
    原作進一步的評估,在老鼠身上可以利用外加注射一些特定的抗原,
    再進行抗原特異性免疫反應的評估,其中可以包括如特異性抗體的測
    定或是抗原特異性的 T細胞增殖反應和細胞激素的研究。至於人體的
    抗原特異性免疫力的評估,則可能必須與疫苗注射來合併進行。同時
    ,如果要評估免疫細胞的功能時,應該分別由質與量兩方面來加以分
    析。量方面主要是測定各種免疫細胞的數目,目前利用螢光流體計數
    儀可以容易地將免疫細胞正確地計算出。由於免疫功能在正常人或是
    為數不少的疾病都扮演著一個重要的關係,未來如果要更正確地評估
    健康食品在這些免疫疾病上的可能調節功能,也許需要另外建立動物
    模式或是經由人體的臨床試驗來加以評估這些功能。
   2    
貳  實驗方法
一  動物實驗
    實驗動物:建議選用小鼠,常用的 Balb/c 或是 B6 小鼠皆可, 6-8
    週大,雄鼠或雌鼠皆可,每組隻數為單一性別至少 10 隻。
 (一) 非特異性免疫反應
      1 脾臟或是淋巴結細胞增殖反應:
        -T 細胞建議使用如Con A 或是 Phytohaemagglutinin (PHA)的
        裂殖素 (mitogen),或是利用交叉連結 (cross-linking)抗 CD3
        抗體來刺激。
        -B 細胞建議使用 Lipopolysaccharide (LPS) 來刺激。
        進行步驟:
      (1) 3H-thymidine incoroperation 法:
          方法較靈敏,將脾臟細胞 2x10000000/ml 置於96-well plate
          ,再加入 Rosewell Park Memorial Institute 培養基 (RPMI
          ) 或添加有LPS, Con A, PHA 等細胞裂殖素的培養基。3於7℃
          CO2培養兩天後,加入1 μCi/well 3H-thymidine,繼續培
          養 20 小時後,以 cell harvester 收集細胞於濾紙上,濾紙
          風乾後以閃爍計數儀測 3H-thymidine 含量,計算細胞增生
          能力。
      (2) MTT 法
          MTT 的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用,
          產生顏色的變化,再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞
          裂殖素的刺激,增生越多,則活的細胞愈多,酵素的活性就會
          較高,可以測到較高的吸光值。利用此一原理,也可以來測定
          細胞的增殖反應,但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確
          度較高,對懸浮性細胞則較不理想,進行本實驗時應特別注意
          。
      (3) 螢光流體計數儀來測定 DNA的染色:
          利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激,細胞核內的 D
          NA是否有任何變化,可以分別利用 Propidium iodide (PI)及
          bromodeoxyuridine  (BrdU) 的方法來染色。PI可以在染色後
          直接利用螢光流體計數儀加以分析,但是 BrdU 的方戶法則需
          要再加上一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光,才能利用螢光流
          體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的 DNA有增
          加的變化,可以同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用
          抗 CD3及抗 B220 抗體先行染色,再將細胞加以固定,然後進
          行 DNA的染色。可以對細胞的表面標記及細胞內的 DNA螢光使
          用不同波長的螢光,以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞
          進行分析。如果能夠達到此一目的,便能夠不需要將細胞分離
          出就可以知道是那些細胞受到活化。
      2 抗體分泌實驗
        血液中免疫球蛋白濃度:目前測定血清內免疫球蛋白的濃度,最
        常利用到的方法為 Radio immunodiffusion  (RID) 法,此種方
        法在使用上較為方便,只要將血清放入培養孔中,靜置 24 至48
        小時後,再測量其直徑大小,與標準值對照,便可以算出免疫球
        蛋白濃度。除此外,也可以利用 sandwich-ELISA ,或是生化的
        方法將免疫球蛋白的濃度計算出來,但是生化的方法可能必須在
        較具規模的醫學中心才能作得到。
      3 細胞激素分泌實驗將分離出的淋巴球以 2x10000000 /ml 的濃度
        置於 24-well 的 Plate 中,利用已經定量過的 Con A或抗 CD3
        抗體來刺激這些淋巴球。經過 24 到 48 小時的培養後,將上層
        液離心下來,以測定其淋巴介質製造的量。在取得足夠檢體以前
        ,可將其它檢體先保存在 -70℃,等到檢體足夠時再一起測試。
        淋巴介質的測定是利用 (sandwich-ELISA法。先利用一個抗淋巴
        介質的抗體先覆蓋在 ELI SA plate 上,在 4℃靜置一晚。在進
        行實驗前先以 1% PBS-BSA  處理後清洗之。再將要處理的檢體
        加到 plate上,置於室溫 2小時後加入 biotin 聯結的抗淋巴介
        質抗體。兩小時的室溫靜置後,加入 avidin 聯結過氧化酵素 (
        avidin-linked peroxidase) ,再靜置二個小時後加入受質以呈
        色。上述裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其
        最適當的濃度,並以已知濃度的淋巴介質作為對照。
      4 分離脾臟細胞及表面標記分析:
        利用頸椎脫臼法分別犧牲老鼠,將脾臟取出並製備成單一細胞懸
        浮液,更進一步利用 Tris-Ammonium chloride 緩衝液將紅血球
        懸浮,而白血球則利用 Hank's 溶液清洗三次後再進行下一步的
        實驗。將單一白血球分離出後,利用 Fluorescein isothiocyan
        ate(FITC) 及 Phycoerythin(PE) 染色的單株抗體來計算不同表
        面標記的比例及數目。這些細胞表面標記的測定將利用於 Fluor
        escence Activated Cell Sorter(FACS) 分析法。
      5 自然殺手細胞活性:
        為要測定實驗動物之自然殺手細胞的活性,可以先培養自然殺手
        細胞的標的細胞 (YAC-1 細胞株) 。原則上也是將 YAC-1  細胞
        與 51Cr 先在一起培養約 4小時,再將殘餘在試管中而未移除的
        51Cr除去。此時再加入不同數目的單核球 (monocyte) 與已經與
        51Cr培養過的標的細胞一起培養,在培養一段時間後取出上清液
        ,放入g-counter內計算其放射強度。在實驗的過程中,利用 NP
        -40 或是 HCl將細胞破壞,以取得51Cr 的最高釋放值。
                    實驗值-背景值
        計算公式= ------------------------------------------
                    最高釋放值-背景值 ×100﹪
      6 吞噬細胞活性:
        吞噬細胞可以分別測定單核球(monocyte)或是中性白血球的吞噬
        能力,目前可以分別利用吞噬細菌如 E. coli、yeast 等方法來
        加以測定,也可以利用已標記好的 E. coli (如螢光) ,在細胞
        吞噬後利用螢光流體計數儀來加以分析。
 (二) 特異性免疫反應
        以卵白蛋白 (ovalbumin,OVA)  (或其他抗原如羊紅血球)對老鼠
        行腹腔注射,以得到抗體生成的曲線圖及時間表。老鼠在餵食一
        個月的飲食後,先採血,以作為整個實驗過程的基本值。開始注
        射卵白蛋白 OVA  致敏老鼠,以得到 OVA  特異性 IgG 及 IgM
        的產生。每隻老鼠注射 2μl Complete Freunds Adjuvant 入腹
        腔內,兩週後再腹腔注射 6μl Incomplete Freunds Adjuvant
        為追加致敏。定期採血以追蹤血清中 OVA  特異性 IgG  及 IgM
        的濃度。
        光值。
      1 OVA 誘發的特異性抗體產生
        首先以 100μl 的 10μg/ml OVA 覆蓋在 ELISA plate  上置放
        在 4℃過夜。翌日將抗原沖洗乾淨後加上 200μl 1% BSA-PBS
        來當阻斷性溶液,置於室溫2 小時或 4℃過夜。將 1% BSA-PBS
        沖洗乾淨後加入欲測的血清樣本,置於室溫 2小時。再加入 bio
        tin-聯結性兔子對抗老鼠 IgG或 IgM抗體,再靜置 2小時。沖洗
        乾淨後再加入 avidin-linked peroxidase ,靜置 2小時。最後
        加入 ABTS 顯色劑呈色約 30 分鐘,以 5% SDS 停止反應後判讀
        其吸光值。
      2 OVA-特異性的T細胞增殖反應
        將脾臟細胞 2x 106/ml 置於 96-well plate,  再加入 RPMI 培
        養基或添加有OVA的培養基。於 37℃ 的 CO2 培養箱兩天後,加
        入 1 μCi/well 3H-thymidine,繼續培養 20 小時後,以 cell
        harvester 收集細胞於濾紙上,濾紙風乾後,以閃爍計數儀測3H
        -thymidine 含量,以計算細胞增生能力。
      3 OVA-特異性的細胞激素製造
        將分離出的淋巴球以 2x106/ml 的濃度置於 24-well 的Plate中
        ,以已知濃度的OVA抗原共同培養來刺激淋巴球。經過 24 到 48
        小時的培養後,取上層液以測定其淋巴介質分泌量。淋巴介質的
        測定基本上是利用 sandwich-ELISA 法。簡言之,是先利用一個
        抗淋巴介質的抗體先覆蓋在 ELISA plate 上,在 4℃ 靜置一晚
        。在進行實驗前先以1% PBS-BSA 處理,再加以清洗。然後將欲
        測定之上清液加到 ELISA plate  上,置於室溫兩小時後再加入
        biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。室溫靜置 2小時後再加入 avid
        in-linked peroxidase,靜置 2小時後,加入受質呈色。
      4 遲發性過敏反應 (delayed-type hypersensitivity) 檢測:
        先將卵蛋白或是綿羊紅血球 (SRBC) 以皮下注射方式注入小鼠左
        後肢,經4 天後測量其足蹼腫脹厚度。再將卵蛋白或是 SRBC 以
        皮下注射方式注入小鼠右後肢,經24小時後測量其足蹼腫脹厚度
        。比較對照組與實驗組小鼠之足蹼厚度增加數值,作為遲發性過
        敏反應之分析依據。
二  人體的臨床試驗:
    人體試驗的免疫功能評估,原則上與動物的評估近似,惟進行人體的
    臨床試驗之前應經過各醫院的人體試驗委員會通過才能加以進行。
 (一) 非特異性免疫反應:
      1 周邊血液單核球 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC
        ) 的反應:
        -T 細胞建議使用如 Con A或是 PHA的裂殖素 (mitogen),或是
            利用交叉連結抗CD3 抗體來刺激
        -B 細胞建議使用Pokeweed mitogen (PWM)  來刺激
        進行步驟:
      (1) 3H-thymidine incoroperation 法:
          方法較靈敏,將PBMC 2x 106/ml  置於 96-well plate, 再加
          入 RPMI 培養基或添加有 LPS (lipopolysaccharide) ,Con A
          ,PHA, PWM 等細胞裂殖素的培養基。於 37℃ CO2 培養箱兩天
          後,加入1 μCi/well 3H-thymidine,繼續培養 20 小時後,
          以 cell harvester 收集細胞於濾紙上,濾紙風乾後以閃爍計
          數儀測 3H-thymidine 含量,計算細胞增生能力。
      (2) MTT 法:
          MTT 的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用,
          產生顏色的變化,再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞
          裂殖素的刺激,增生越多,活的細胞愈多,則酵素的活性就會
          較高,可以測到較高的吸光值。利用此一原理,也可以來測定
          細胞的增殖反應,但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確
          度較高,對懸浮性細胞則較不理想,進行本實驗時應特別注意
          。
      (3) 螢光流體計數儀來測定DNA 的染色:
          利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激,細胞核內的 D
          NA  是否有任何變化,可以分別利用 Propidium iodide (PI)
          及 bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。PI可以在染色
          後直接利用螢光流體計數儀加以分析,但是 BrdU 的方法則需
          要再加上一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光,才能利用螢光流
          體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的DNA 有增
          加的變化,同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用抗 C
          D3  及抗 B220 抗體先行染色,再將細胞加以固定,然後進行
          DNA 的染色。可以對細胞的表面標記及細胞內的 DNA  螢光使
          用不同波長的螢光,以在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分
          析。如果能夠達到此一目的,便能夠不需要將細胞分離出就可
          以知道是那些細胞受到活化。
      2 抗體分泌實驗
        血液中免疫球蛋白濃度:目前測定血清內免疫球蛋白的濃度,最
        常利用到的方法為 radio immunodiffusion (RID)  法,此種方
        法在使用上較為方便,只要將血清放入培養孔中,靜置 24 至 4
        8 小時後,再測量其直徑大小,與標準值對照,便可以算出免疫
        球蛋白濃度。除此外,也可以利用 sandwich-ELISA ,或是生化
        的方法將免疫球蛋白的濃度計算出來,但是生化的方法可能必須
        在較具規模的醫學中心才能作得到。
      3 細胞激素分泌實驗
        將分離出的淋巴球以 2x106/ml 的濃度置於 24-well 的 Plate
        中,利用已經定量過的 Con A 或抗 CD3 抗體來刺激這些淋巴球
        。經過 24 到 48 小時的培養後,將上層液離心下來,以測定其
        淋巴介質製造的量。在取得足夠檢體以前,可將其它檢體先保存
        在 -70℃,等到檢體足夠時再一起測試。淋巴介質的測定是利用
         sandwich- ELISA  法。先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在
        ELISA plate 上,在4℃ 靜置一晚。在進行實驗前先以 1% PBS
        -BSA  處理後清洗之。再將要處理的檢體加到 plate  上,置於
        室溫 2小時後加入 biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。兩小時的室
        溫靜買後,加入 avidin 聯結過氧化酵素 (avidin-linked pero
        xidase) ,再靜置二個小時後加入受質以呈色。上述的裂殖素的
        濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其最適當的濃度,並
        以已知濃度的淋巴介質作為對照。
      4 自然殺手細胞活性
        為要測定實驗動物之自然殺手細胞的活性,我們先培養自然殺手
        細胞的標的細胞 (K-562 細胞株) 。原則上也是將 K-562細胞與
          Cr先在一起培養約 4小時,再將殘餘在試管中而未移除的  Cr
        除去。此時再加入不同數目的單核球與已經與  Cr培養過的標的
        細胞一起培養,在培養一段時間後取出上清液,放入γ-counter
        內計算其放射線強度。在實驗的過程中,利用 NP-40或是 HCl將
        細胞破壞,以取得  Cr的最高釋放值。
                    實驗值-背景值
        計算公式=───────── ×100%
                  最高釋放值-背景值
      5 吞噬細胞活性:
        吞噬細胞可以分別測定單核球或是中性白血球的吞噬能力,目前
        可以分別利用吞噬細菌如 E. coli、yeast 等方法來加以測定,
        也可以利用已標記好的 E. coli (如螢光) ,在細胞吞噬後利用
        螢光流體計數儀來加以分析。
      6 周邊血液單核球的表面標記分析:
        人類的周邊血液單核球的表面標記分析,利用含有sodium citra
        te的試管來收集檢體,再利用 FITC 及 PE 染色的單株抗體來計
        算不同表面標記的比例及數目。這些細胞表面標記的測定將利用
        於 FACS 分析法。
 (二) 特異性免疫反應
      人體的特異性免疫反應的評估主要是利用疫苗的接種,來評估其反
      應。建議的疫苗為破傷風類毒素 (tetanus toxoid, TT) ,由於破
      傷風經常使用到,而且得到的結果顯示也可以達到相當理想的免疫
      反應,所以可以利用 TT 來進行此類的評估。其他的疫苗也可以加
      以考慮,可以配合人體試驗時是否正在注射相關的疫苗來加以考量
      。
      1 TT誘發的特異性抗體產生
        將 100μl 的 10μg/ml TT覆蓋在 ELISA plate上,置放在 4℃
        過夜。翌日將抗原沖洗乾淨後加上 200μl 1 % BSA-PBS  來當
        阻斷性溶液,置於室溫 2小時或 4℃過夜。將 1% BSA- PBS 沖
        洗乾淨後加入欲測的血清樣本,置於室溫 2小時。再加入biotin
        - 聯結性兔子對抗人類IgG或 IgM 抗體,再靜置 2小時。沖洗乾
        淨後再加入avidin-linked peroxidase,靜置 2小時。最後加入
         ABTS 顯色劑呈色約 30 分鐘,以 5% SDS停止反應後判讀其吸
         光值。
      2 TT- 特異性的 T細胞增殖反應
        將 PBMC 2× 1000000 /ml 置於 96-well plate ,再加入 RPMI
        培養基或添加有 OVA的培養基。於 37℃ 的 CO2培養箱兩天後
        ,加入 1μCi/well 3H-thymidine ,繼續培養 20 小時後,以
        cell ha rvester 收集細胞於濾紙上,瀘紙風乾後,以閃爍計數
        儀測 3H-thymidine含量,以計算細胞增生能力。
      3 TT- 特異性的細胞激素製造
        將分離出的淋巴球以 2×1000000 /ml 的濃度置於 24-well  的
        Plate 中,以已知濃度的 TT 抗原共同培養來刺激淋巴球。經過
        24 到 48 小時的培養後,取上層液以測定其淋巴介質分泌量。
        淋巴介質的測定基本上是利用 sandwich-ELISA 法。簡言之,是
        先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在 ELISA plate上,在 4℃
        靜置一晚。在進行實驗前先以 1% PBS-BSA處理,再加以清洗。
        然後將欲測定之上清液加到 ELISA plate上,置於室溫 2小時後
        再入 biotin 聯結的抗淋巴質抗體。室溫靜置 2  小時後再加入
        avidin-linked preoxidase,再靜置 2小時後,加入受質呈色。
      4 遲發性過敏反應 (delayed-type hypersensitivity, DTH) 檢測
        :
        人體的延遲性過敏反應是利用已經製成商業製劑的套組來進行,
        這些製劑中的常用抗原包括 TT 、白色念珠菌等抗原。要測定這
        些抗原的 DTH,係將這些抗原注射入皮內,再分別經過 24 及48
        小時,分別記錄皮膚的紅腫直徑範圍。其結果也應該與正常人的
        反應作一個比較。
        上述的免疫評估是指一般免疫功能的評估,如果要進一步探討如
        對病毒感染、過敏疾病、風溼病或是腫瘤的免疫功能,應該另外
        建立動物模式或是進行相關的人體臨床試驗來加以評估。
   3    
參  評估方法之原則要求
    建議依照上述實驗項目及方法,可以分別針對非特異性及特異免疫功
    能的評估而決定其實驗項目。
   4    
肆  結果判定之基準
    判定的基準原則上依據上述實驗項目及方法進行相關研究,統計分析
    有意義者判定其功能。

 

 

黃尚銘 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()