健康食品之延緩衰老功能評估方法 

(民國 92 年 08 月 29 日修正)

 

   1    
壹  前言
    老化是許多分子、細胞及系統方面的一種效應改變。分子與細胞的老
    化是基因 (內在) 與環境 (外在,如熱、冷、疾病、營養素缺乏等因
    素) 所造成。而系統的老化是器官某部分的變化,最常見的是皮膚上
    的變化,例如變硬、變粗及生皺等。所以老化細分為功能上 (funct-
    ion)、行為上 (behavior) 及外表上 (performance)  上的變化。
    老化現象是一種普遍性 (universal)、進行性 (progressive)、累積
    性 (cumulative) 及傷害性 (deleterious)  之內外因素所引發之生
    理衰退。由於生物個體間、不同人生階段或時期之老化步伐及表現不
    一,所以無法以單一或簡單的模式來加以描述。也因為如此,隨年齡
    的增加,族群間之歧異 (diversity/heterogeneity)  也加大,增加
    很多複雜性。隨著年齡造成的生理功能衰退,有兩種情形,一為純粹
    與年齡增長有關之功能衰退 (ae-related physiologic deteriorat-
    ion),另一為出現伴隨年齡增長之疾病 (age-associated disease)
    ,但兩者往往共同存在。
    老化學說大致上可分為兩類:基因預設 (genetic program)  與隨機
    破壞 (stochastic) 。前類學說認為預設的基因結構或基因表現的改
    變導致老化;另一類則將老化歸因於體內大分子物質像核酸、蛋白質
    隨時間所累積的隨機破壞超過體內的修復能力,這些隨機破壞可以來
    自自由基 (free radical) 、氧化作用 (oxidation)  或醣化作用 (
    glycation)  等。持平而論,老化可能是多種因子所共同參與的過程
    ,而遺傳與各種環境因子亦都扮演舉足輕重的角色。
    關於老化的原因,迄今已提出的學說和意見不勝枚舉。其中最具信賴
    性的學說為自由基學說 (free radical theory)。自由基是指構成物
    質的原子團在分子狀態下有不成對電子的情形,這種電子結構極不穩
    定,易與其他分子發生反應。在所有自由基種類中,以含氧自由基對
    人體的健康最密切。它的產生方式有兩種:一種是由身體內正常新陳
    代謝所產生,即當細菌、黴菌、病毒或異物等入侵時,體內防衛系統
    在吞噬異物後,會產生「含氧自由基」。另一種是受外界不正當因素
    的影響,例如輻射線或紫外線、抽菸、空氣污染等,甚至心理壓力也
    會形成含氧自由基。一但體內自由基的數量超出人體天然防禦的範圍
    ,造成氧化壓力 (oxidative stress) ,則各種疾病與老化便接踵而
    至。因此,當自由基形成後就會造成連鎖反應,促使蛋白質、碳水化
    合物、脂肪、核酸等構成細胞物質的氧化,造成過氧化脂質的堆積,
    進而破壞體內的細胞膜、蛋白質及核酸等,使生理功能逐漸消失,產
    生疾病。若能增加生物體內抗氧化防禦系統之作用,以分解活性氧物
    質,則能有效減少細胞傷害,延緩生物體的衰老與死亡。
    生物體內的抗氧化防禦系統大致可分為:一級防禦系統 (primary d-
    efense system)  及二級防禦系統 (secondary defense system) 。
    一級防禦系統如維生素C、維生素E、glutathione 及抗氧化酵素如
    超氧化物歧化   (SOD)、過氧化氫?及穀胱甘?過氧化   (glutathio-
    ne peroxidase)  等,其作用可直接清除活性氧物質或抑制活性氧物
    質之氧化;二級防禦系統包括脂質分解酵素 (lipolytic enzyme) 、
    蛋白質分解酵素 (proteolytic enzyme) 及 DNA  修復酵素 (DNA r-
    epair enzyme) 等,其負責清除活性氧物質之氧化性產物,修復受損
    的細胞及彌補在一級防禦系統中無法清除的自由基衍生物。
    在衰老學說中有一假說為「脂褐質累積」學說。脂褐質含 30~70%蛋
    白質,20~50 %脂質,4~7 %碳水化合物及微量金屬。其主要堆積在
    有絲分裂後的細胞,例如神經元、心肌細胞、視網膜細胞等。脂褐質
    是經由蛋白質的水解及多元不飽和脂肪酸氧化後之產物,亦是脂質氧
    化和糖化作用的聚合物,故可以利用 periodic acid-schiff stain
    和 Sudan black B  等特殊染色劑的染色後經過組織切片進行特異性
    標識。
    過去二十年有關老化機制 (mechanism of aging) 的理論與資料眾多
    ,每一種理論很難以一種簡單、直接的方式,明白解釋原因與結果之
    間的關係。因而老化研究的目的乃在:(1) 檢測老化的經常性或一般
    性之持續變化;(2) 確認某些變化來自老化而非來自疾病,界定健康
    與疾病的分野;(3) 了解老化現象的根本原因及伴隨老化而來的疾病
    。並將所得到的結果分析作綜合研判,建立基本資料庫,以得到新的
    發現或發掘新的問題。
   2    
貳  實驗項目與實驗方法
一  動物實驗
 (一) 生存實驗
      利用生物的整個生存過程來觀察受試物對壽命的影響。
    (1) 小鼠生存實驗
        a 條件:選用小鼠 12 月齡小鼠,每組 40 隻,雌雄各半;
        b 分組:隨機分成 1  個正常對照組和 3  個實驗劑量組,其中
          一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量,小鼠擴大 10 倍 (必
          要時得依受試物之特性另定之) ,作為其中 1  個劑量,以此
          為基礎,另設兩個劑量。
        c 實驗方法:一般用灌胃法,摻入飼料法或加入飲水法給予受試
          物,從 12 月齡開始給予,直到死亡。然後每天統計其死亡鼠
          數,直至全部自然死亡。比較實驗組與對照組的平均壽命和最
          高壽命,畫出其生存曲線圖,計半數動物死亡的天數。
    (2) 大鼠生存實驗
        a 條件:選用大鼠 18 月齡大鼠,每組 30 隻,雌雄各半;
        b 分組:如同小鼠生存實驗,但其中一組為人體每公斤體重每日
          推薦攝取量大鼠擴大 5  倍。
        c 實驗方法:如同小鼠生存實驗,從 18 月齡開始給予,直到死
          亡。
    (3) 果蠅生存實驗
        a 條件:選用果蠅 Oregen 品系,雌雄分組,每個分組雌雄果蠅
          各 200  隻,分裝在 10 個培養管內,每管 20 隻。
        b 分組:需有四種劑量組,受試物推薦劑量=每天每人推薦攝入
          量 (g)/3000 ×100 %,以此濃度為中間劑量,按 3  倍組距
          上下各設1或2個劑量組。若受試物處理時使用了普通培養基中
          未使用的溶劑,則還應另設 1  個溶劑對照組。
        c 實驗方法:收集羽化後 8  小時內未交配的果蠅進行分組,用
          二氧化碳氣體麻醉,待果蠅完全麻醉後倒出,雌雄分組,每個
          分組雌雄果蠅各 200  隻,分裝在 10 個培養管內,每管 20
          隻。每個劑量組均應準備 2~3 管裝有相同數目果蠅的後備管
          ,作為遇到特殊情況時的補充。成蟲從分窩 2  週後開始並重
          新給予受試物 (雌雄果蠅按培養管分別秤重,計算平均體重)
          。果蠅放入受試物培養基後實驗即正式開始,每天定時觀察紀
          錄果蠅的死亡數,每 4  天更換一次培養基,一直觀察到果蠅
          全部死亡。實驗結束,計算半數死亡天數,平均壽命和平均最
          高壽命 (每組最後死的 20 隻果蠅的平均存活天數為該組的最
          高壽命) 。
 (二) 生化實驗
      1 動物選擇:老齡動物、過氧化損傷處理動物或國際認可之老化模
        型動物任選其一。
      2 劑量分組及受試物試驗期間:
        設 1  個空白對照組,1 個模型對照組及 3  個受試物劑量組,
        根據人體每日每公斤體重推薦攝取量,小鼠擴大 10 倍 (大鼠擴
        大 5  倍) ,必要時得依受試物之特性另定之,作為其中 1  個
        劑量,以此為基礎,另設 2  個劑量。每組大鼠單一性別 8-10
        隻,小鼠單一性別 10-15  隻。受試物經口連續至少給予 30 天
        ,視研究必要可延長實驗期間。3 個劑量組經口給予不同濃度受
        試物,模型對照組和空白組給予同體積溶劑。
      3 實驗方法:
      (1) 老齡動物
          選用 15 月齡大鼠、12  月齡小鼠,按血中 MDA  水平分組,
          隨機分為 1  個老齡對照組和 3  個受試物劑量組,另增設 1
          個少齡對照組 (大鼠 3  月齡,小鼠 8  週),30 天後犧牲動
          物測氧化指標和生化指標。
      (2) 過氧化損傷模型動物
        (A) D-半乳糖模型:
            a 原理:D-半乳糖供給過量,大量產生活性氧,打破了受控
              於遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態,引起過氧化
              效應。
            b 動物模型方法:選 3  月齡健康成年的小鼠,用 D- 半乳
              糖 1.2 g/kg.bw  頸背部皮下注射模型,注射量為 0.1ml
              /10g.bw ,每日 1  次,連續 6  週,取血測 MDA,按 M
              DA  水平隨機分組,如上述之分組方式。在給受試物同時
              ,除空白對照組外,各組繼續給予 D- 半乳糖 1.2g/kg.
              bw  頸背部皮下注射,空白對照組皮下注射生理鹽水,30
              天後,犧牲動物測氧化指標和生化指標。
        (B) 輻照模型:
            a 原理:電離輻射通過直接破壞生物膜中不飽和脂肪酸和間
              接通過水輻解產生自由基,引發脂類過氧化。
            b 動物模型方法:選 18-22 g  健康成年小鼠,隨機分 5
              個組,如上述之分組方式。30  天後,除空白對照組外,
              各組給予 5-8Gy60Coγ  射線全身一次性照射,照射後第
              3 、4 天犧牲動物,取肝組織 (或第 9、10  天犧牲動物
              ,取睪丸組織) 測氧化指標和生化指標。
        (C) 溴代苯模型:
            選 18-22g 健康成年小鼠,隨機分 5  個組,如上述之分組
            方式。30  天後,動物禁食過夜,給受試物 0.5-1  小時後
            ,除空白對照組外,各組灌胃 0.3 mol/L  溴代苯油,灌胃
            量 0.2 ml/20g.bw,空白對照組灌胃同體積植物油,大約
            18-22 小時後犧牲動物,取肝組織測氧化指標和生化指標。
      (3) 老化模型動物
          依國際認可老化模型動物之特徵,選用適當月齡之小鼠,分 1
          個老齡對照組和 3  個受試物劑量組,另增設 1  個少齡對照
          組。30  天後,犧牲動物測氧化指標和生化指標。
二  人體實驗
    1 背景說明:
      一種健康食品必須以科學方法證明可延緩人體內至少一個以上器官
      功能衰老的速率或延長服用者之壽命,才能充分取信大眾此食品確
      有抗老防衰之效能。由於不同器官衰老的速率與原因未必相同,即
      使證明某食品可延緩甲器官老化,也不可據以推論此食品也延緩乙
      器官老化,必須針對不同器官逐一求證才符合科學之精神,但研究
      者可同時觀測多個器官功能隨老化所發生之變化。
    2 計畫執行單位:
      需委託國內外大學食品、營養、醫藥等相關研究所或醫學中心執行
      ,需有臨床試驗專家或醫師參與,並遵循衛生主管機關有關人體試
      驗之規定。
    3 受試食品:
      必須有科學文獻佐證其成分具有延緩器官功能衰老或延長壽命之效
      能,並經健康食品安全性評估方法證明在有效劑量範圍對人體不會
      有顯著急、慢性不良反應。
    4 受試者:
      未服用任何藥物身心健康之成年人,需包括部分老年人 (六十五歲
      以上) ,需有對照組與實驗組,每組不少於二十人,由臨床試驗專
      家視實驗特性與設計之需要,依學理推算適當之受試人數,以免樣
      本太小無法統計。受試者須被充分告知試用食品之可能不良反應,
      並簽立同意書,才能收案。
    5 觀察指標之選定:
      實驗設計者依其所欲證明可延緩老化之器官,並參酌以往科學文獻
      評估該器官功能之方法,決定所需觀察之效能指標。例如:使用肌
      酸酐廓清率來評估腎絲球功能,使用 FEV1 來評估肺功能。針對每
      一器官選定之指標項目愈多,且每一指標皆因測試食品之使用而改
      善,則說服力愈強。此外,也必須訂有不良反應之觀察指標。
    6 試驗流程:
      收集受試者基本資料與所有觀察指標之基礎值後,實驗組投予試用
      食品,對照組服用安慰劑至少六個月。安慰劑之外型應力求與試用
      食品相同。試驗期間與期終需追蹤觀察指標若干次。期滿後兩組對
      調,原對照組改服試用食品,實驗組改服安慰劑,重複整套觀察流
      程一次。觀察期間之設定由臨床試驗專家依每一器官老化之速率,
      食品之效能與受試者之特性推估而定。實驗過程宜採雙盲方式進行
      ,開方者與受試者不知服食之內容。受試者並應避免干擾觀察指標
      之因子。
三  判定基準:
  (1) 動物實驗 (生存及生化) 與人體實驗都要做。若人體試驗沒顯著延
      緩衰老效果,但動物實驗看到有不錯的結果,建議可允許標示為〝
      在動物實驗表明有延長生命作用〞。
  (2) 動物之生存實驗可簡化,果蠅不用做 (因為不是哺乳動物) ,其中
      大鼠或小鼠之材料可選其中之一項即可。
  (3) 人體實驗可多加功能性的血液檢查。
   3    
參  生化實驗測定項目
一  氧化指標
 (一) 氧化修飾後蛋白羰基功能基含量測定 1-3
    (1) 分光光度測定法:
        取血清或腦脊液 (serum or CSF) ,並將樣品先行將核酸去除
          。檢體先在 6000 g 離心 10 分鐘,當 280/260 nm 波長之比
          率小於 1.0  時,表示核酸含量多。故檢體必須加入 10 %
          streptomycin sulfate  直到其最終濃度為 1%。試管放置於
          常溫 10 分鐘,而後在 6000 g 離心。將上清液與沈澱物 (p-
          recipitate) 分開,分析步驟如下:
            ────────────────────────
              試   劑         空  白  管        樣  品  管
            ────────────────────────
              萃取蛋白        1.0 c.c.          1.0 c.c.
              10 mM DNPH (in   -                4.0 c.c.
              2.5 M HCl)
              2.5 M HCl       4.0 c.c.          -
            ────────────────────────
              混勻,避光常溫培育 60 min ,每 15 分鐘 vortex 一次
            ────────────────────────
              20% TCA (w/v)  5.0 c.c.          5.0 c.c.
            ────────────────────────
              放置於冰浴 10 分鐘,離心 5  分鐘,上清液棄除,收集
              沈澱,以 4.0 c.c. 的 ethanol/ethyl acetate  清洗 3
              次,棄除未經作用之過剩 DNPH 以及脂肪。
            ────────────────────────
              6 M guanidine   2.0 c.c.          2.0 c.c.
              hydrochloride
        加入上述試劑可將沈澱物溶解。Vortex  混勻並放置常溫 10
          分鐘。若有不沈澱之雜質,用離心法將之棄除。每一樣品要在
          335-390 nm  波長掃描 (以空白管做為 blank) ,羰基含量可
          以最大吸光之吸光度 (peak absorbance)  求取之 (以吸光係
          數ε=22,000 M-1C-1  計算濃度) 。同時,樣品管之蛋白量要
          以 280 nm 之吸光度求取之。最後配合樣品管之蛋白量,即可
          換算成 nmol/mg  之羰基量。故總羰基量可以下式求取之:
                        Absorption (Abs)  Abs (355-390 nm)
          c (nmol/ml) = ────────  ─────────
                              ε            2.2 ×10^4/10^8
                      = Abs (355-390 nm) x 45.45 nmol/ml
        組織之羰基量測定:
          步驟與上述相同,但要事先做組織之 homogenization 。將
          150-200 mg  組織放入塑膠盤 (plastic dishes) ,加入 3.0
          c.c. homogenizing buffer。用剪刀將組織剪成細片,常溫放
          置 15 分鐘,將含蛋白之溶液分離,並在 6000 g 離心,將雜
          質去除。用 280/260 nm 之比率判別是否含核酸太高。如果太
          高,則用 streptomycin sulfate 去除。
    (2) 高效率層析測定法 (High-performance liquid chromatography
        ) :
        使用 TCA  或硫酸胺 (ammonium sulfate) 濃縮獲取沈澱物。
        將沈澱物分為兩組,其中一組充當 derivatization blank ,
          另一組樣品則用來做 derivatization 。將樣品放於有蓋之 1
          .5 ml 塑膠試管。加入 3  倍體積之 derivatization 試劑,
          混勻,藉以溶解樣品。放置在常溫 15-30  分鐘。使用 in-
          line  之濾網棄除不溶物。將樣品注射進入儀器分析條件:HP
          LC column: Column :Zorbax GF450 (Mac-Mod analytical,C-
          hadds Ford, PA, USA or Dionex, Sunnyvale, CA. USA);M-
          obile phase (6.0 M Guanidine hydrochloride, 0.5 M pot-
          assium phosphate pH 2.5);flow rate: 2 min/ml ;注意波
          長 276  及 370 nm 之層析圖譜。
        計算:                 (εprotein 276) (Area 370)
          測定 mole of carbonyl  ───────────────
               per mole of pro   22,000 (Area276-0.43 Area370)

          [note:ε276 nm = 9460 (43% of that at 370 nm)]

          但如果測定一個peak內有若干物質時,其使用之計算式為:
                Area×flow
          mol = ────────
                ε×path length
 (二) 測定血漿蛋白含硫功能基及谷胱甘  4-6
    (1) 血漿全部含硫功能基之測定
        方法:0.20 ml 之 plasma 放置於 1-ml 試管中,依序加入0.
          6 ml Tris-EDTA buffer (Tris base 0.25 M, EDTA 20 mM),
          pH 8.2., 40 μl 10 mM DTNB 及 3.16 ml  絕對甲醇 (Abso-
          lute methanol)。將所有試管以管蓋蓋住,等待呈色產生 (15
          -20 分鐘)。在 3000 g  離心 10 分鐘 (常溫狀況下) 。讀取
          上清液之吸光度 (412 nm;A)  減去 DTNB 之空白管吸光度 (
          B)  故全部之血漿含硫功能基是可由下式求取之:
          Total SH groups = (A - B - 0.03) x (4.0/0.2) / 13.6
                          = (A - B - 0.03) X 1.47 (mM)
          [Note:0.03 = Sample blank;吸光係數 = 13,600 M-1 cm-1]
        方法:50 μl plasma + 1.0 ml Tris-EDTA,讀取吸光度 (A1
          ) ,加 20 μl 10 mM DTNB  於上管。在常溫放置15分鐘,再
          度讀取吸光度 (A2) ,並測 DTNB 之空白管取光度 (B)  則
          Total SH groups = (A2 - A1 - B) X (1.07/0.05) / 13.6
                          = (A2 - A1 - B) X 1.57 (mM)
    (2) 血漿谷胱甘  濃度測定:
        0.5 ml  血漿+ 0.5ml cold 10 % TCA
        放置於冰浴中 10 分鐘,並在 3000 g 離心 15 分鐘
        0.2 ml  的上清液+1.7 ml phosphate/EDTA buffer+0.1 ml
          OPD 試劑
        放置於室溫 15 分鐘,測定螢光強度 (激發波長=350 nm ;放
          光波長= 420 nm)
        樣品之谷胱甘月太量,則可由 GSH  之標準曲線上換算求得
        注意事項:抽煙之血漿檢體會干擾 (A)  及 (B)  之測定結果
          。棄除上述干擾之方法為先將血漿之蛋白 (50 μl) 用 1 ml
          5 % TCA in 5 mM EDTA)  沈澱,再將沈澱物浮懸在 Tris-ED
          TA buffer後 ,再做呈色反應。
 (三) DNA 之 8  羥基-2'-去氧鳥嘌呤核  之高效率層析法之測定 7,8
    (1) DNA 樣品之製備及水解
      (A) DNA 之萃取步驟:
          將 1  克之組織加入 4c.c.之 homogenizing buffer (0.3 M
          sucrose, 0.025 M Tris,0.002 M EDTA, final pH 7.3) 後做
          homogenization 10-15  秒,加入同體積的 DNA extraction
          solution [1.0 M LiCl, 2 M urea, 0.04 M sodium citrate,
          0.005 M disodium EDTA, 2% sodium dodecyl sulphate (SD
          S), pH 6.8,此溶液並通過 0.45 μm membrane  過濾,且貯
          存在室溫] 。RNA-free DNA, 加入 RNase (100 μg/ml) 在50
          ℃條件下培育 30 分鐘,再加入 proteinase K (100-300 μg
          /ml),在 50 ℃條件下培育 30-120 分鐘,接著加入等體積
          chloroform/isoamyl alcohol (24/1) ,使水相/有機相互相
          混合約 15 分鐘,2000-3000 g 離心 5  分鐘使水相及有機相
          分開,取水相再重覆 chloroform/isoamyl alcohol (24/1)
          萃取,至少三次。最後取水相,加入 1/15 體積之 3 M sodi-
          um acetate (pH =5.3)  及 2-2.5  倍體積之 95 %酒精,並
          在 3,000~4,000 g 條件下離心使核酸沈澱,沈澱的核酸以
          70%酒精清洗二次,然後 Air dry  樣品並將之溶於 Tris/ED
          TA solution (0.010 M Tris ,0.001 M EDTA,pH 7.4) 。最
          後測定在 260  及 280 nm 之吸光度,並以 260 nm 之吸光度
          計算 DNA  濃度 (當 260/280  比值接近 1.8  時,則 DNA
          不再含有蛋白) 。
      (B) DNA 之水解 (DNA digestion):
          將 DNA  用 0.25 ml Tris/EDTA  溶解,加入 0.025 ml 0.5
          M sodium acetate,pH 5.1  以及 2.75 μl 1 M MgCl2 ,將
          上面混合液加熱至 100℃ (水浴) 5 分鐘 (以製備單股 DNA)
          ,速將其放入冰浴 5  分鐘,加入 10 μg nuclease P1 (1mg
          /ml 之水液放置於 4℃,可重覆稀釋使用) ,並在 37 ℃條件
          培育 60 分鐘,利用 8 μl 1 M Tris base  調節 pH 至 7.8
          ,加入 2 μl (2 units) alkaline phosphatase 並在 37 ℃
          條件下培育 60 分鐘,最後加入 4 μl 5.8 M  醋酸 (acetic
          acid) 使酵素沈澱。將混合液過濾 (0.2 μm HPLC filter)。
          濾過液將可注射至 HPLC 。
    (2) HPLC-ED 方法偵測 8-OHdG
        利用 Waters Associates (Milford, MA, USA) 510 模式的
          solvent delivery system[含 Rheodyne 7125 (Cotati, CA,
          USA) injector]及 3 μm Supelcosil (B, PA. USA) LC-18-
          DB column (15 cm x 4.6 mm)。
        Mobile phase [50 mM KH2PO4 buffer, pH 5.5 及甲醇 (90:
          10 v/v)]。
        Flow rate 為 0.8 ml/min (back pressure 2000 psi)。Sam-
          ples are analyzed by separate UV [Kratos model 773 UV
          detector (Westwood, NI, USA)] and EC [Bioanalytical
          system (West Lafayette), IN, USA] LC-4B amperometric
          detection system [使用polytetrafluoro-ethylene CPTFE
          tubing]。
 (四) 以血球為模式評估抗氧化製劑對降低自由基氧化損傷評估方法 9-
      12
    (1) 全血離心後,將血漿及 buffy coat 棄除。紅血球以 10 mM ph-
        osphate buffer, pH 7.4 (含135 mM NaCl) (PBS)  洗三次。再
        將血球加入 PBS  使其 hematocrit 約為 10 %。將製劑放入
        10% FCS [最後濃度為 1:105~104 (w/v)] ,然後加入 25 mM
        AAPH。另外一管則僅含 10 % FCS,亦加入 25 mM AAPH 做為
        control 。將所有試管在 37 ℃條件下培育 6  小時。
    (2) 分析項目:在定時 (1, 2, 3, 4, 5 或 6  小時) 分別取出適量
        紅血球,同時測定四項指標。即 (A)  溶血度 (B)  血中谷胱甘
        月太量 (C)  脂質過氧化指標 -MDA (D) SDS-PAGE  胞膜蛋白型
        式。
        倘若製劑有保護作用,則以上四種指標與 control  比較會有明
        顯差異。
 (五) 定量磷脂膽鹼過氧化氫 (Phosphatidylcholine hydroperoxide ,
      PCOOH)  以及磷脂乙醇胺過氧化氫 (Phosphatidylethanolamine
      hydroperoxide ,PEOOH)13
    (1) 原理:PCOOH 及 PEOOH,乃是脂質過氧化作用的最初產物,利用
        超微弱化學發光儀 (Chemiluminescence-high Performance Li-
        quid Chromatography ,CL-HPLC),使用後置管柱通入對過氧化
        物具有特異性的化學發光的試劑,也就是魯米諾 (Luminol)  和
        細胞色素丙 (cytochrome C) 的混合溶液來測此二產物,而且可
        以去除其他雜質,這種方法比測量 TBARS  更具有特異性。
    (2) 實驗方法:
      (A) 血漿磷脂過氧化氫之定量:1.0 ml  血漿,加入 4.0ml  冰冷
          的 CHCl3/甲醇 (2:1,V/V)  的萃取溶劑 (包含 0.002%的
          BHT),混合1分鐘,在 3000 rpm 下離心 10 分鐘,收集下層
          的氯仿,再加入」1ml 0.15M NaCl,溶液到上層包含半固體介
          面的甲醇/水層,再重新用 CHCl3/甲醇萃取下層 CHCl3,用
          無水 Na2SO3  (大約 1g)  脫水,用 Toyo 5C  濾紙過濾,用
          氮氣吹乾,重新溶解在 50 μl 的 CHCl3/甲醇 (2:1,V/V)
          ,注入 20 μl 到 CL-HPLC。
      (B) 老鼠肝及腦磷脂過氧化氫之定量:500 mg (淨重) 肝或腦,加
          入 1.0 ml 0.15 M NaCl 溶液 (包含 0.002%BHT),在冰冷的
          條件下用鐵氟龍-玻璃均質機均勻化,加入 4.0 ml 冰冷的氯
          仿/甲醇 (2:1,V/V)  溶液 (包含 0.002%BHT),收集下層
          的 CHCl3,再加入 1 ml 0.15M NaCl,溶液到上層包含半固體
          介面的甲醇/水層,再重新用 CHCl3/甲醇萃取下層的 CHCl3
          ,用無水 Na2SO4(大約 1g)  脫水,用 Toyo 5C  濾紙過濾,
          用氮氣流體蒸發,重新溶解在 100 μl  的 CHCl3/甲醇 (2
          :1 ,V/V),注入 20 μl溶液到 CL-HPLC 。
      (C) 分析條件:
          管柱:TSK-Gel Silica 60 (5 μm,250×4.6 mm,Toso Co
            . Tokyo,Japen)
            移動相:CHCl3:CH3OH:n-propanol:H2O=1:9:2:0.1
            (V/V)
            幫浦1:1.1 ml/min
            幫浦2:1.0 ml/min
            化學發光試劑: (10 μg/ml)  cytochrome C  和  (1 μg
            /ml)  魯米諾溶解在 50 mM borate 緩衝液 (pH 9.3)
            化學發光偵測器:TEIC CL OX-7  分析儀 (Tohoku Electr-
            onic Industries)
          管柱:JASCO Finepak SIL NH2-5 (n-propylamine-bound
            Silica column 5 μm, 250×4.6 mm)
            移動相:己烷/2-propanol/甲醇/水 (5:7:2:1,V/V)
            幫浦1:1.0 ml/min
            幫浦2:1.1 ml/min
            化學發光試劑: (10 μg/ml) cytochrome C 和 (2 μg/ml
            ) 魯米諾溶解在 50 mM
            borate  緩衝液 (pH 10.0)
            混合接頭溫度:40℃
            化學發光偵測器:TEIC CLD-110 (試料室溫度 40 ℃)
            UV  吸收度在 205 nm
 (六) HPLC- Fluorescence Detector 方法偵測 TBARS  含量之測定 14
    (1) 細胞以 PBS  洗滌三次,再加入適量體積的 PBS,全血離心後取
        血漿約 0.05 ml。0.05 ml 的樣品或標準品 (大約含 0.1~20 m
        g 蛋白質) 加入 0.75 ml  的 phosphoric acid (0.44 M) 溶液
        混和均勻,再加入 0.25 ml TBA (42 mM),加熱至 95 ℃,60
        分鐘。冷卻後,離心 9500g 10 分鐘。取上清液 0.5 ml 再加入
        0.5 ml methanol-NaOH (4.5 ml 1N NaOH  加 methanol 至 50m
        l)  溶液混合均勻,取 0.05 ml  供 HPLC 儀器測量。
    (2) 標準品製備:0.05 ml 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TPE) (
        purity 98﹪MW 220.3 Da) 以 40 ﹪ethanol 配成 25 ml stock
        solution,每月配製,保存 4℃中。取 0.5 ml stock solution
        以 40 ﹪ethanol 配成 100 ml ,再各取 0.375、0.75、1.5 、
        3.0 ml  以水配成 25 ml,其濃度分別為 0.61 、1.22、2.43、
        4.86  新鮮配製。
    (3) HPLC  分析條件:
        HPLC column: uBondpack C18 (39×300 mm)
        Mobile phase (400 ml methanol 加上 600 ml phosphate buf-
        fer 50 mM, pH6.8)
        flow rate: 2 min/ml
        Fluoresence detector: Ex=532 nm; Em=550 nm
 (七) 判定基準:
      1 六項氧化指標中,可任選三項做實驗,至少須要一組實驗為正反
        應 (positive data),並且不能有負相反應 (negative data)。
      2 以上氧化指標之實驗方法,若有文獻或有其他科學方法佐證之,
        亦可採用。
二  生化指標
    測定項目:超氧化物歧化酵素、葡萄糖六磷酸去氫酵素、觸酵素、麩
    胱甘  過氧化酵素、麩胱甘  還原酵素活性測定方法
    樣本的準備:
  (1) 血漿和紅血球樣品:收集 0.5-2 ml 的血液入 heparinized tube
      ,輕輕的混合,並且立即離心 (1000 g,10 min,4 ℃) ;可將血
      漿等分並存於 -70℃,直到分析前。移除 buffy coat 並用約 5
      倍體積的冰 saline 來洗紅血球兩次;在第二次清洗完後,加入約
      20  倍體積的 0 mM phosphate buffer,pH 6.6  去溶解此紅血球
       (此 lysate可存於 -70 ℃,直到分析前) ;在分析前,加入等量
      的 double-strength Drabkin's  試劑到 hemolysate 中,以轉換
      全部的 haemoglobin  成穩定的 cyanmethaemoglobin 型式,用於
      定量血紅素 (haemoglobin)。
  (2) 組織樣品:利用冰的 0.25 M sucrose buffered with 10 mM HEPE
      S ,pH 7.4,或 1.15 % KCl  在 0.05 M phosphate buffer,pH
      7.6 來準備 10 %均質物 (homogenate) ,並在 4℃離心以獲得所
      需的細胞內物質 (可存於 -70℃,直到分析前) ;在使用前,利用
      超音波震盪或冷凍-解凍細胞內胞器 2-3 次。若所使用的組織,因
      其具有較高的酵素活性,進一步的稀釋為必要的。
 (一) 超氧化物歧化酵素 (Superoxide dismutase,SOD) 活性之測定 15
      -16 組織樣品製備如上述,取適量以供測量。紅血球 lysate  (備
      如上述) 1 ml,加上 0.4ml ethanol/chloroform 後混和均勻,離
      心1000g ,10  分鐘,取萃取上清液待測。依序加入下列試劑:H2
      O 860μl、Tris buffer (0.5M Tris, pH 8.2) 100μl、樣品或
      SOD 標準品 20μl、pyrogallol (10 mM) 20μl,混和均勻後掃描
      波長 420nm  吸光度 5  分鐘,計算ΔOD/min,並對照標準品推算
      SOD 活性。
      比活性表 (specific activity)  示法:SOD IU/mg of protein (
      or mg of hemoglobin)。
 (二) G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase)  活性測定
      組織樣品或紅血球 lysate 製備如上述,取適量以供測量。依序加
      入下列試劑:H2O 590μl、Tris buffer (1.0 M, pH 8.0) 100μl
      、MgCl2 (0.1M) 100μl 、NADP (2mM) 100μl 、樣品 10μl,混
      合後於 37 ℃,3 min 再加入 100μl G6P (6mM) 快速混合後於
      37℃波長 340nm  下測 10 分鐘內吸光值的變化。
      計算:IU/ml= (Δ340nm/min÷6.22)/sample volume
      IU:係指在測定條件下,每分鐘能產生 1μmole NADPH  之酵素量
          。
      比活性表 (specific activity)  示法:G6PD IU/mg of protein
       (or mg of hemoglobin)。
 (三) 過氧化氫酵素 (Catalase) 活性測定方法 17
      組織樣品製備如上述,取適量以供測量。紅血球 lysate  (製備如
      上述) 1 ml,加上 0.4 ml ethanol/chloroform  後混和均勻,離
      心 1000g,10  分鐘,取萃取上清液待測。依序加入下列試劑 H2O
      540 μl 、Tris buffer (1M Tris, 5mM EDTA, pH 8.0) 100μl、
      saturated thymol 100μl 、aminoantipyrine (10mM) 100μl 、
      樣品或 catalase 標準品 10μl、peroxidase (1 U/ml) 100μl、
      saturated thymol H2O2 50μl 。均勻混和後於波長 505nm  掃描
      其吸光度,取第五分鐘之吸光值。對照標準品吸光值曲線計算出樣
      品中 catalae  活性。
      比活性表 (specific activity)  示法:catalase IU/mg of pro-
      tein (or mg of hemoglobin)。
 (四) 麩胱甘  過氧化酵素 (Glutathione peroxidase,GSH Px) 活性之
      測定 18
      組織樣品或紅血球 lysate 製備如上述,取適量以供測量。配製
      coupling reagent 100 ml (2 mM EDTA、1 mM NaN3 、1 mM GSH、
      0.2 mM NADPH、100 units GSH redutase、50 mM Tris-HCl buff-
      er,pH 7.6,此試劑以新配為佳,可在室溫下 6-8  小時或在 4℃
      下 24 小時;NaN3  可抑制 catalase 活性)。再以 50 mM Tris-
      HCl buffer (pH 7.6) 配 hydroperoxide substrate (1mM hydro-
      gen peroxide  以新配為佳、4.8 mM cumene hydroperoxide 可存
      於 -20℃> 1 個月)。每 10-100 μl sample preparation 加入
      965-875 μl of the coupling mixture 在 37 or 25 ℃下作用
      2-3 分鐘;再加入 25 μl of a hydroperoxide substrate  開始
      反應 (無 sample 的 blank values 亦需測得) ,觀察在波長 340
      nm  其吸光值在 1-2  分鐘內的減少量 (亦即 NADPH  消失的速率
      )。
      計算:IU/ml= (Δ340nm/min ÷6.22)/sample volume
      IU:係指在測定條件下,每分鐘能產生 1μmole NADPH  之酵素量
          。
      比活性表 (specific activity)  示法:GSH Px IU/mg of prote-
      in (or mg of hemoglobin)。
 (五) 麩胱甘  還原酵素 (Glutathione reductase ,GSH Rd) 活性之測
      定 19
      組織樣品或紅血球 lysate 製備如上述,取適量以供測量。取 sa-
      mple 40 μl ,GSS G(2.2 mM) 100μl,NADPH (0.17 mM) 200μl
      混合於並測5分鐘內溫度 37℃下,波長 340nm  吸光值的變化。
      GSH Rd activity  計算公式 :U/L=4983×△A 340nm/min
      比活性表 (specific activity)  示法:GSH Rd IU/mg of prote-
      in (or mg of hemoglobin)。
 (六) 判定基準:
      1 五項生化指標中,至少須要三組實驗為正反應 (positive data)
        ,並且不能有負相反應 (negative data)。
      2 以上生化指標之實驗方法,若有文獻或有其他科學方法佐證之,
        亦可採用。
參考資料
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