健康食品之促進鐵吸收功能評估方法 

(民國 95 年 10 月 05 日修正)

 

 

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一、背景說明(1-16)
    根據聯合國糧農組織與世界衛生組織(FAO/WHO) 之報告,缺鐵仍是
    不可忽視的營養缺乏問題之一,除了盛行於經濟落後與開發中國家之
    外,在經濟富裕之歐美先進國家也沒有完全解決。缺鐵的定義是體內
    鐵儲存耗竭,並且增加貧血的危險,而貧血是缺鐵末期的症狀。美國
    自 1943 年開始強制實行麵粉營養強化措施,添加的營養素包括維生
    素 B1、B2 、菸鹼素與鐵,然而根據美國最新之健康調查 NHANES II
    I (1988-1994),美國缺鐵盛行率以生育年齡女性有 9-11 %最高
    ,其次是 1–2 歲幼兒 9 %,50  歲以上女性也有 5–7  %之多,
    男性缺鐵率則低於 2  %。瑞典之調查指出其青少年之缺鐵盛行率超
    過 15 %,女性甚至高達 40 %。我國「第一次國民營養健康狀況變
    遷調查」同時利用血鐵蛋白濃度、運鐵蛋白飽和度和血紅素濃度等血
    液指標評估鐵營養狀況。四歲以上國人之總缺鐵率為男性 2.1  %,
    女性 10.7 %﹔鐵儲存耗盡之比例為男性 1.3  %,女性 7.7  %﹔
    缺鐵貧血率為男性 0.2  %,女性 2.1  %﹔國人缺鐵問題與歐美國
    家雷同,都是以無臨床症狀之缺鐵為主,並且有明顯的性別差異,以
    女性較男性為嚴重。除了 65 歲以上老人兩性之缺鐵率均高之外,男
    性缺鐵率最高的是 13 –18  歲,與青春期之快速成長有關﹔女性則
    從 13 –64  歲都有 9  %以上之缺鐵率,以 30 –50  歲有 14.2
    %最高,快速成長與月經都有重要的影響,另外因體重控制而減少攝
    食量或食物選用不當,也可能增加缺鐵之危險。
    缺鐵為一漸進而連續的變化過程,初期為體內儲存之鐵耗盡,進而使
    血液中運送之鐵短缺,逐漸不敷造血組織之需要,最後導致血紅素之
    合成不足,而造成貧血症狀。因此,缺鐵可分為「無貧血性缺鐵」與
    「缺鐵性貧血」兩大類。
    貧血發生之前,通常沒有明顯易辨之症狀。貧血發生之後,多種生理
    機能不良之症狀就明顯可辨,諸如:肌肉勞動效力明顯降低,無法從
    事劇烈短促的活動,影響肌肉的生理和能量代謝效率,增加心臟的負
    荷等。缺鐵貧血與嬰幼兒精神性運動能力不良有關,並且有行為異常
    的現象,使心智發展明顯較差,包括:語言能力差,運動協調與平衡
    不佳,注意力、反應靈敏度與情緒的分數均明顯較低,甚至有長期的
    影響,因為長期追蹤發現,缺鐵貧血幼兒於五年或十年後其認知能力
    與學習成就仍然較為低落。
    無貧血性缺鐵也會降低認知能力,缺鐵之高中女生經過鐵補充之後,
    可以提升其語言學習與記憶能力。美國 NHANES III 調查中發現, 6
    –16  歲兒童青少年中,缺鐵者的數學得分顯著較健康者為低,風險
    比例 (odds ratio) 高達 2.3  。富裕社會中無貧血性缺鐵盛行率
    仍然居高,由於涉及學習發展,故對兒童青少年的鐵營養狀況必須密
    切注意。
    缺鐵影響免疫機能,根據人體與動物實驗證實,缺鐵主要影響兩項免
    疫功能:中性白血球吞噬細菌能力降低,T 淋巴細胞對細胞增生劑或
    抗原的反應降低。缺鐵還會增加鉛中毒的危險,美國兒童中缺鐵者鉛
    中毒的比例較健康者高出 3~4 倍。因為缺鐵時小腸負責鐵吸收的蛋
    白質 DMT1 表現增加,但是它缺乏專一性,故對其他二價金屬元素,
    包括鉛、鉻等重金屬的吸收率也伴隨增高。
    國人缺鐵問題仍然存在,我國並未全面實行食物加鐵強化之措施,因
    為缺鐵問題有個人之差異,並非人人需要補鐵,而且體內鐵儲存大幅
    增加並不增添益處。因此發展各種補鐵食品以供消費者依個人需要選
    用,配合個人日常飲食以維護鐵營養之充足,有其積極正面之意義。
    已知影響鐵吸收的主要因素有鐵的化學形式與鐵可用率(bioavaila-
    bility)。鐵的化學形式主要區分為「血鐵質」(heme iron) 與「
    非血鐵質」(non-heme iron) 兩種。「血鐵質」主要來自肉類,其
    吸收不受其他飲食成分的影響,但是受鐵營養狀況之調節,吸收率平
    均 25 %,缺鐵時可提高到 40 %,鐵充足時可降到 10 %。長時間
    高溫烹調會使「血鐵質」分解成「非血鐵質」。「非鐵血質」來自各
    種植物性食品,鐵蛋白(ferritin)以及鐵補充劑等等,其吸收率平
    均約 7.5  %,缺鐵時可提高到 21 %,鐵充足時會降為 2.5  %。
    飲食成分會影響「非血鐵質」的吸收率,促進吸收的成分主要有維生
    素 C  和禽畜魚等肉類,維生素 C  含量在 25 –100 mg之間與鐵吸
    收率有正比關係,增高劑量並無進一步的效益。肉類包括禽、畜、魚
    貝等動物之肌肉蛋白質,其消化分解之小分子產物可以與鐵形成可溶
    性錯合物以增加鐵的溶解度而促進吸收。西式乳酸發酵之蔬菜、發酵
    黃豆製品也有促進鐵吸收的效益。
    由於飲食鐵質之吸收並不完全,故以鐵可用率代表食物或飲食中可被
    人體正常消化、吸收並供生理利用的鐵,這是綜合數個生理過程的結
    果,這些過程大致上可分為三個步驟:(1) 消化,(2) 小腸細胞
    攝入鐵(iron uptake) 與血液運輸,及(3) 形成功能性蛋白質以
    執行生理功能。因此,測量上述過程可以反映鐵可用率。
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二、鐵可用率評估原理(4,15, 16)
    目前食物鐵可用率的評估方法分為體外(in vitro)測量法、動物實
    驗法與人體實驗法三種。
    體外測量法有體外消化透析法(in vitro digestion and dialysis
    )與體外消化– Caco-2 細胞攝鐵法(in vitro/Caco-2 cell cult-
    ure model )。體外消化透析法是根據可溶性、小分子鐵錯合物才可
    能被人體吸收的原理,採用模擬胃腸消化作用之條件,將食物消化分
    解後,利用透析膜分離小分子含鐵成分,稱為「可透析鐵」(dialy-
    zable iron),測量其比例以間接代表鐵可用率,所得之結果與人體
    鐵吸收率顯著相關。體外消化– Caco-2 細胞攝鐵法除了利用模擬胃
    腸消化作用之條件與透析膜分離小分子含鐵成分之外,加上細胞模式
    以模擬小腸之吸收作用,吸收之鐵可誘導細胞內鐵蛋白之生合成,兩
    者有正相關性,故以鐵蛋白量間接代表鐵可用率。Caco-2  細胞源自
    人類大腸腺細胞瘤(colon adeno-carcinoma) ,會自發性分化,並
    擁有許多小腸細胞的特性,包括極化(polarization)的型態、形成
    微絨毛(microvilli)與 tight junction ,細胞內有儲鐵用之鐵蛋
    白,並且具有與鐵吸收相關的 DMT1、HFE  等各種蛋白質,多種促進
    或抑制鐵吸收之成分可影響其攝鐵作用,與小腸之反應相似。在美國
    國家衛生院(NIH) the Office of Dietary Supplements 與 the
    American Society of Nutritional Sciences  的研討會中,此法被
    認為具有高度的應用價值,所測得之結果與人體鐵吸收率顯著相關。
    動物實驗法採用最為普遍的是 AOAC (Association of Official A-
    nalytical Chemists)建議之「大鼠血紅素再生法」(rat hemoglo-
    bin repletion bioassay)。其原理是利用缺鐵貧血大鼠對食物鐵質
    有最大的吸收能力,並且優先用於合成血紅素,故飼以含鐵食物或化
    合物後,追蹤其血紅素濃度之增加,可以反映食物之鐵可用率,可用
    來區別不同鐵源的利用效率。此法屬於『終點』(endpoint)測量法
    ,符合鐵可用率的定義。國際營養性貧血顧問小組(International
    Nutritional Anemia Consultative Groups)曾經比較 AOAC 法與人
    體試驗測得之鐵可用率,發現兩者顯著相關,可作為人體鐵可用率之
    參考。動物實驗法之主要限制是不適合評估促進鐵吸收之成分,因為
    缺鐵貧血大鼠的鐵吸收率很高,足以掩飾其他促進因子的效應。AOAC
    法自 1974 年建立以來並無任何修訂版本,然而隨著動物實驗技術之
    進步,以及鐵吸收機制之新知,其基礎飼料配方已不適用,修訂之配
    方(表一)及條件應參考蕭氏之行政院衛生署委託計畫研究報告《改
    良並建立我國保健食品補鐵機能評估的檢測方法》(36)。
    人體實驗法可以直接反映食品之鐵可用率,是補鐵功能的最佳指標。
    雖然鐵之吸收利用可以放射性同位素鐵追蹤定量,但此等方法在國內
    難以執行。可行的方法是以缺鐵貧血者為試驗對象之血紅素增生法,
    提供促進鐵吸收健康食品,使其依照食品使用說明服用,定期追蹤血
    紅素等鐵營養相關指標之增加量,據以評估鐵可用率。
    人體對鐵之吸收利用有其恆定調控機制,健康食品可以經由改變鐵之
    形式,提供促進鐵吸收之成分或去除抑制鐵吸收之成分等策略以提高
    食品之鐵可用率。因此健康食品促進鐵吸收功效可以依產品特性採用
    不同評估方法(表一)。
    實驗結果符合下列三項標準之一,即可評定為具有促進鐵吸收之功能
    :
    1.人體實驗結果獲得顯著的促進效應
    2.體外消化–Caco-2  細胞攝鐵實驗或大鼠血紅素再生實驗獲得顯著
      的促進效應
    3.體外消化透析法配合體外消化–Caco-2  細胞攝鐵實驗,或體外消
      化透析法配合動物實驗獲得顯著的促進效應。

    表一、促進鐵吸收之產品策略與適用之評估方法
    ┌────┬───────────────────────┐
    │產品策略│適用之評估方法                                │
    ├────┼───────────────────────┤
    │改變鐵之│1.人體試驗                                    │
    │形式    │2.大鼠血紅素再生法                            │
    │        │3.體外消化–Caco-2  細胞攝鐵法                │
    │        │4.體外消化透析法+體外消化–Caco-2  細胞攝鐵法│
    │        │5.體外消化透析法+大鼠血紅素再生法            │
    ├────┼───────────────────────┤
    │提供促進│1.人體試驗                                    │
    │鐵吸收之│2.體外消化–Caco-2  細胞攝鐵法                │
    │成分    │3.體外消化透析法+Caco-2  細胞實驗            │
    ├────┼───────────────────────┤
    │去除抑制│1.人體試驗                                    │
    │鐵吸收之│2.大鼠血紅素再生法                            │
    │成分    │3.體外消化–Caco-2  細胞攝鐵法                │
    │        │4.體外消化透析法+Caco-2  細胞攝鐵法          │
    │        │5.體外消化透析法+大鼠血紅素再生法            │
    └────┴───────────────────────┘
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三、評估方法與步驟
(一)體外消化透析法(in vitro digestion and dialysis) :簡稱「
      透析法」(17–21)
      1.儀器設備
        食物研磨機、pH  測定儀(pH meter)、控溫震盪培養箱或控溫
        震盪水浴槽(shaker incubator)、原子吸收光譜儀(atomic
        absorption photometer) 、分光光度計(spectrophotometer
        )。
      2.主要器材
        透析膜 MWCO 6,000 ~8,000 (Spectra/Por),使用之前以去
        離子水浸泡 12 小時;有蓋高型玻璃燒杯,容量 100–150 mL;
        透析膜夾等。實驗用玻璃器皿均應以酸液浸泡,經去離子水沖淨
        ,去除鐵之污染後方可使用。
      3.藥品與試劑
        胃蛋白(pepsin):porcine ,活性 800–2500 units/mg p-
        rotein。
        胰臟酵素(pancreatin):porcine,活性 4 x U. S. P. spec-
        ifications。
        膽汁萃取物(bile extract):glycine and taurine conjuga-
        tes of hyodeoxycholic and other bile salts。
        各種酸鹼試劑與藥品必須無微量礦物質污染,包括:HCl、NaHC-
        O3、trichloroacetic acid(TCA) 、hydroxylamine hydroch-
        loride、sodium acetate、bathophenanthroline disulfonate
        、原子吸光分析用鐵標準溶液等。
        胃蛋白溶液(pepsin solution) ,簡稱「胃液」每 100 mL
        的 0.1 N HCl溶液中含 2.5–5 g 胃蛋白,加入離子交換樹脂
        (Chelex-100)2.5 –5 g ,室溫震盪反應 30 分鐘,離心或過
        濾移除樹脂以去除試劑中之鐵後,置於玻璃血清瓶中,儲存於 4
        ℃下,於一星期之內使用。
        胰液-膽鹽懸浮液(pancreatin-bile suspension),簡稱「胰
        液」
        每 100 mL 的 0.1 M NaHCO3 溶液中含 0.2–0.4 g 胰臟酵素及
        1.2 –2.5 g 膽汁萃取物,加入離子交換樹脂(Chelex-100)15
        g ,室溫震盪反應 30 分鐘,離心或過濾移除樹脂以去除試劑中
        之鐵後,置於玻璃血清瓶中,儲存於 4  ℃下,於一星期之內使
        用。
        還原劑溶液
        於 250mL  去離子水中溶解 100 g hydroxylamine hydrochlor-
        ide ,加入離子交換樹脂(Chelex-100)2-5 g ,室溫震盪反應
        30  分鐘,離心或過濾移除樹脂以去除試劑中之鐵後,置於玻璃
        血清瓶中備用。
        蛋白質沉澱劑
        100 g TCA 以去離子水定容至 500 mL ,嚴防鐵污染。
        鐵呈色劑,可透析鐵定量分析之用,組成分為:
        250 mg bathophenanthroline disulfonate  先溶於 50mL 去離
        子水,再加入 250 mL 還原劑溶液及 4M Na-acetate  溶液 500
        mL,最後以去離子水定容至 1L 。
        鐵對照溶液
        以 FeSO4  溶於 0.01 N HCl ,適用的濃度為 10-100 μM ,實
        驗時選用與測試樣品相當之濃度,使用時新鮮配製。
      4.實驗方法及步驟
        每次實驗應包含以下組別:
     (1)控制組:鐵對照溶液或其與不含健康食品之基礎飲食的組合,
          含鐵量與實驗組相當,除了不含健康食品之外,基礎飲食之組
          成與特性應與實驗組相近。
     (2)正對照組:鐵對照溶液或其與不含健康食品之基礎飲食的組合
          ,含鐵量與實驗組相當,除了不含健康食品之外,基礎飲食之
          組成與特性應與實驗組相近,另外加入 ascorbic acid,使莫
          耳數比例 ascorbate:Fe= 20:1 。
     (3)實驗組:健康食品或含健康食品之飲食,鐵量與控制組相當。
          健康食品若添加含鐵成分,應符合我國「食品衛生管理法」、
          「食品添加物使用範圍與用量標準」等相關法規。
        每次實驗各種處理至少應有二重複,每個實驗至少重複兩次。
        體外法必須小心控制的條件是 pH 值、酵素活性與反應時間,圖
        一為透析法的實驗流程。測試樣品若為液態則可直接使用,若為
        固型物則需加入適量去離子水,以研磨機將樣品均質成乳狀「樣
        品漿」,紀錄樣品與水之比例與重量。
        模擬胃液消化反應樣品液或「樣品漿」以 6N HCl 調為 pH 2 ,
        每 100g 樣品液加入 5 mL 胃蛋白溶液,於 37 ℃下震盪反應
        2 小時而得「胃消化物」,取 20g  供酸度滴定之用,其餘暫時
        冰凍保存以待下一步模擬小腸消化反應與鐵定量之用。
        酸度滴定  目的是定量「胃消化物」加上「胰液」後,欲使混合
        物酸鹼度達到小腸環境之 pH 7.5 ,所需之 KOH  當量數。對 2
        0g  的胃消化物加入 5 mL 的胰液,混合均勻後,以 0.5N KOH
        滴定至 pH 7.5 ,紀錄所需 KOH  當量數,換算為 NaHCO3 量。
        模擬小腸消化反應  準備透析袋,利用酸度滴定結果,將中和所
        需之 NaHCO3 溶於 25mL 去離子水,裝入透析袋中,袋口夾緊毋
        使滲漏以備用。將冰凍之「胃消化物」解凍,以 20g  為單位秤
        取分裝,分別置於 100ml  燒杯中,然後將透析袋置入燒杯中,
        加蓋,於 37 ℃下震盪反應 30 分鐘,使鹼度升高到 pH 5 ,然
        後加入 5 mL 「胰液」,繼續反應 2  小時。結束時,取出透析
        袋,以去離子水和緩地沖洗其外部以去除消化物之干擾後,倒出
        袋中透析液,收集於塑膠離心管或玻璃瓶中,紀錄體積後,供可
        透析鐵之定量分析。
      5.分析項目與方法
        樣品總鐵量分析  剩餘「胃消化物」秤取適量,經灰化處理後,
        灰份以濃 HCl  溶解完全,經適當稀釋後,以比色法或原子吸收
        光譜儀配合鐵標準溶液與標準檢量線而定量。灰化反應需嚴防鐵
        污染,所需容器必須浸泡酸液後充分清洗方可使用。
        可透析鐵量分析  取定量透析液,加入蛋白質沉澱劑(沉澱劑:
        透析液= 1:2,v/v),充分混合後,於沸水浴中加熱 10 分鐘
        ,4000×g 離心 10 分鐘去除蛋白質沉澱。取上清液置於試管中
        ,加入鐵呈色劑(上清液:鐵呈色劑 = 1:1, v/v),反應 10
        分鐘後,測定波長 535 nm 吸光值,比對鐵標準檢量線求出濃度
        。鐵標準檢量線以鐵標準溶液(線性範圍 0.5–4 ppm) 經相同
        之鐵呈色定量步驟,測得吸光值後而製作。上清液若經適當消化
        分解有機物質後,也可以採用原子吸收光譜儀測定其鐵量。
      6.計算
        各組之「可透析鐵」以下列公式計算,並以百分比(%)表示:


      「可透        透析液鐵濃度(μg Fe/mL)×透析液體積(mL)
      析鐵」=100 %──────────────────────
      比例(        樣品總鐵量(μg Fe/mL)×20 g
      %)

        每次實驗各種處理至少應有二重複,每個實驗至少重複兩次。若
        各次實驗之間沒有顯著差異,則實驗結果可以合併以計算可透析
        鐵比例之平均值與標準偏差,並以標準偏差對平均值之百分率代
        表該分析之變異係數(coefficient of variation, CV)。測試
        樣品「鐵可用率」以實驗組之「可透析鐵」比例平均值對控制組
        之「可透析鐵」比例平均值之百分率表示。正對照組之「鐵可用
        率」以該組之「可透析鐵」比例平均值對控制組之「可透析鐵」
        比例平均值之百分率表示。
      7.結果評定
        促進鐵吸收之判斷標準為實驗組之「鐵可用率」大於 100  %+
        2 ×CV(實驗組),表示有促進鐵吸收之性質,可用率數值越高
        越好,以超過 ASC  組者為最優;「鐵可用率」小於 100  %-
        1 ×CV(實驗組)者表示測試樣品可能有抑制鐵吸收之性質。
(二)體外消化– Caco-2 細胞攝鐵實驗:簡稱「細胞實驗」(22–32)
      1.儀器設備
        二氧化碳細胞培養箱(CO2 incubator) 與細胞培養操作之基本
        設施、迴轉式震盪器、原子吸收光譜儀或同類儀器、酵素免疫分
        析儀(ELISA reader)。
      2.主要器材
        75-cm2  培養瓶或培養皿(culture flask or culture dish)
        、彈性矽膠帶(silicon ring)、collagen  處理之六槽細胞培
        養盤(collagen treated 6-wells culture dish) 、塑膠離心
        管、透析膜 MWCO 12,000-14,000 (12-14 K, Spectra/Por),
        使用前以去離子水浸泡 12 hr。細胞培養盤內槽(Transwell i-
        nsert ring),使用前槽底外部覆以透析膜(圖二),用彈性矽
        膠帶固定,以 70 %酒精殺菌後,浸置於無菌水中備用。實驗用
        玻璃器皿均應以酸液浸泡,經去離子水沖淨,去除鐵之污染後方
        可使用。
      3.藥品與試藥
        細胞培養基:Minimum Essential Medium(MEM) ,配方中不含
        外加鐵,鐵濃度不可超過 8μg/L 細胞生長培養液(growth me-
        dium):簡稱「生長液」,供細胞增生與維持之用,組成分含有
        :DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、10  %(v/v
        )FBS (fetal bovine serum)、25 mmol/L HEPES、1  % an-
        tibiotic-antimycotic solution MEM 營養液:攝鐵反應之細胞
        培養液,使用時新鮮配製,以 MEM  為溶劑,並加入:10 mmol/
        L PIPES、1  % antibiotic-antimycotic solution、hydroco-
        rtisone (4 mg/L)、insulin (5 mg/L)、sodium selenite
        (5 μg Se/L)、triiodothyronine(34 μg/L),epidermal
        growth factor(20μg/L)。
        細胞清洗液:簡稱「清洗液」,於實驗開始、中途變換培養條件
        、實驗結束時,用來清洗細胞,以去除前段培養液的影響,組成
        份為:
        140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM PIPES(piperazine-N,N'-bis-
        [2-ethanesulfonic acid]) pH 7.0。
        除鐵溶液(iron removal solution) :簡稱「除鐵液」,用來
        減少細胞上非專一性結合之鐵,以「清洗液」為溶劑,於使用時
        加入鐵螯合劑等其他成分,組成份除了「清洗液」之外,加入:
        1 mM bathophenanthroline disulfonic acid(BPDS)、5 mM
        sodium hydrosulfite。
        EBSS/MES溶劑:使用時新鮮配製,組成份為:Earle's balanced
        salt solution (EBSS、10 mM MES (2-[4-morpholino]-etha-
        nesulfonic acid)buffer pH 6.0。
        鐵對照溶液:供攝鐵實驗中控制組之用,含有 EBSS/MES 溶劑與
        10-100 μmol/L FeSO4。
        正對照組溶液(ASC) :供攝鐵實驗中正對照組之用,含有 EBS
        S/MES 溶劑、10-100μmol/L FeSO4、ascorbic acid(對 Fe 莫
        耳比例為 20 : 1)。
        負對照組溶液(NTA) :供攝鐵實驗中負對照組之用,含有 EB-
        SS/MES  溶劑、10-100μmol/L FeSO4、nitrilotriacetic acid
        (對 Fe 莫耳比例為 5:1 )。
        體外消化用藥品及試劑與體外消化透析法所用相同
        其他試劑有市售鐵蛋白酵素免疫分析試劑組(Ferritin ELISA
        kit) 、Bio-Rad DC protein  試劑等
      4.細胞株來源與培養條件:
        Caco-2  細胞株可購自新竹食品工業研究所或美國 ATCC (Ame-
        rican Type Culture Collection, Rockville, MD)。
        細胞培養於生長液中,接種密度為 5.6×103 cells/cm2 ,或 1
        .68 ×104 cells/mL。
        二氧化碳培養箱之氣體條件為 5  % CO2/95 % air,維持飽和
        溼度,每三天更新生長液。細胞增生至 80 –100 %滿盤(con-
        fluency) 時可進行繼代培養(subculture)。
        繼代培養時,以 trypsin-EDTA 處理使細胞脫離盤底,離心收集
        ,計數細胞數目,調整濃度至接種密度以進行培養。
      5.攝鐵實驗用細胞準備:
        取 80 –100 %滿盤的 Caco-2 細胞,以 trypsin-EDTA 處理收
        集,用生長液將細胞密度調為 5×104 cells/cm2 或 1.65 ×10
        5 cells/mL,置入六槽培養盤,每 2  天更新一次生長液,於 1
        2 –14  天後細胞增生達到 90 ~100 %滿盤,即可開始攝鐵實
        驗。此時細胞間生成緊密的構造(tight intercellular junct-
        ions),使物質無法從細胞間隙通透,而必須從細胞膜攝入。
      6.試驗樣品之處理
        視健康食品的物性而定,若健康食品為液態,並且不需要消化即
        可吸收,則直接進行細胞攝鐵實驗。若健康食品為固態,或必須
        經過消化後方能發揮作用或吸收,則需進行下述之消化反應:取
        適量食品與 120 mmol/L NaCl  溶液混合均質,使均質液之蛋白
        質濃度約為 0.5 mg/10 mL ,並以 6N HCl 調整至 pH 2 後,取
        10 mL 均質液加入「胃液」0.5 mL,置於塑膠離心管中,加蓋後
        水平放置,於 37 ℃下震盪反應 1  小時而得「胃消化物」,然
        後以 1 mol/L NaHCO3 逐滴加入以調整其酸鹼度達 pH 6.0 ,加
        入 2.5 mL「胰液」,以 NaOH  調整至 pH 7.5 ,最終體積以 1
        20 mmol/L NaCl  溶液定容為 15 mL,暫稱為「待消化物」,立
        即用於細胞攝鐵實驗,實驗流程如圖二所示。
      7.實驗設計及步驟
        每次攝鐵試驗應包含以下組別:
     (1)控制組:以鐵控制溶液替代實驗樣品,可依需要採用單一鐵量
          或系列鐵量。
     (2)正對照組:以 ASC  溶液替代實驗樣品,可依需要採用單一鐵
          量或系列鐵量。
     (3)負對照組:以 NTA  溶液替代實驗樣品,可依需要採用單一鐵
          量或系列鐵量。
     (4)實驗組:健康食品溶液或「待消化物」,含鐵量與控制組相同
          ,可依需要採用單一鐵量或系列鐵量。健康食品若添加含鐵成
          分,應符合我國「食品衛生管理法」、「食品添加物使用範圍
          與用量標準」等相關法規。
          每次實驗各種處理至少應有二重複,每個實驗至少重複兩次。
          若各次實驗之間沒有顯著差異,則實驗結果可以合併進行統計
          分析,計算平均值與標準偏差。攝鐵實驗開始時,先將「生長
          液」吸除,以 MEM  清洗兩次,各槽加入「MEM 營養液」 1.0
          mL。每槽置入一個透析內槽,內槽中加入 2.5 mL 各組樣品液
          或「待消化物」,加蓋後置於迴轉釋震盪器反應,震盪速度每
          分鐘 6  轉,反應時間 2  小時,然後移去內槽,培養盤移入
          培養箱繼續反應滿 24 小時,即可收集細胞以供分析。每次實
          驗必有不含細胞,但其他處理均相同之空白組以供鐵定量對照
          之用。
          攝鐵反應結束時,先收集空白組槽內全部溶液,以供鐵之定量
          。其餘含細胞各槽,以 2 mL 「清洗液」清洗細胞後吸除,加
          入 2 mL 去離子水,於 4  ℃冷房中以桌上型超音波震盪器震
          盪處理 15 分鐘,刮下細胞,並收集槽內全部溶液,貯存於–
          20  ℃,以待後續分析。
      8.分析項目與方法
        各槽之細胞蛋白質量可以 0.5 N NaOH 完全溶解細胞後,採用 B
        io-Rad DC protein 試劑半微量法分析定量。細胞「鐵蛋白」含
        量以市售酵素免疫分析試劑組依其說明定量分析,結果以每槽「
        鐵蛋白」總量表示。食材、培養液、細胞液等之鐵含量以原子吸
        收光譜儀定量。
      9.統計分析與計算
        每次實驗各種處理至少應有二重複,每個實驗至少重複兩次。若
        各次實驗之間沒有顯著差異,則實驗結果可以合併用於計算「鐵
        蛋白」量之平均值與標準偏差,並以標準偏差對平均值之百分率
        代表該分析之變異係數(coefficient of variation, CV)。
        採用單一鐵量時,測試樣品之「鐵可用率」以實驗組「鐵蛋白」
        量平均值對鐵控制組「鐵蛋白」量平均值之百分率表示。正對照
        組之「鐵可用率」以該組「鐵蛋白」量平均值對鐵控制組「鐵蛋
        白」量平均值之百分率表示。負對照組之「鐵可用率」以該組「
        鐵蛋白」量平均值對鐵控制組「鐵蛋白」量平均值之百分率表示
        。採用系列鐵量時,各樣品先以「鐵蛋白」量對樣品鐵量製作劑
        量反應曲線並計算斜率。測試樣品之「鐵可用率」以實驗組斜率
        對鐵控制組斜率之百分率表示。正對照組之「鐵可用率」以該組
        斜率對鐵控制組斜率之百分率表示。負對照組之鐵可用率以該組
        斜率對鐵控制組斜率之百分率表示。
     10.結果評定
        促進鐵吸收功能之判斷標準為實驗組「鐵可用率」大於 100  %
        + 2 ×CV(實驗組),表示有測試樣品有促進鐵吸收之性質,可
        用率越高越好,以超過 ASC  組者為最優;「鐵可用率」小於 1
        00  %–1 ×CV(實驗組)者表示測試樣品可能有抑制鐵吸收之
        性質。
(三)動物實驗:大鼠血紅素再生法,簡稱「血紅素再生法」(33–43)
      ,主要參考資料為行政院衛生署委託計畫研究報告《改良並建立我
      國保健食品補鐵機能評估的檢測方法》(36)
      1.實驗動物
        實驗動物採用 Wistar 雄性大鼠,鼠齡限定為離乳,約四週大,
        體重不宜超過 70 公克,以快速達到缺鐵貧血階段,縮短耗鐵期
        時間。若動物體重較大,則耗鐵期時間必然增長,方能達到必要
        的缺鐵貧血程度。實驗動物之飼養遵循基本程序,大鼠個別飼養
        於不鏽鋼絲籠中,動物室溫度維持在 25 ±2 ℃,溼度維持 50
        %,光暗週期各為12小時。實驗期間供給去離子水。水與飼料均
        採自由攝食。動物管理應遵循國科會《實驗動物管理及使用守則
        》(43)。
      2.藥品與試劑
        Drabkin's 試劑含 1g NaHCO3、50 mg KCN、200 mg K3Fe(CN)
        6 ,溶於 1L 蒸餾水中,貯於棕色瓶中備用。本試劑含氰化物,
        毒性大而危險,不可以口吸取,廢液需集中處理,不可倒入水槽
        。
        各種酸鹼試劑與藥品必需無微量礦物質污染。各項分析用玻璃器
        皿均應以酸液浸泡,經去離子水沖淨,去除鐵之污染後方可使用
        。
      3.飼料配方
        「基礎飼料」採用 AIN-76 或 AIN-93G  配方,但其碳水化合物
        完全採用玉米澱粉,其礦物質混合物中不加鐵,其組成列於表二
        ,此飼料之鐵濃度應不超過 3 ppm。標準對照組於「血紅素再生
        期」(簡稱「再生期」)用含鐵飼料稱為「鐵標準飼料」,乃以
        「基礎飼料」添加 Fe SO4.7H2O 而配成之一套四種鐵濃度之飼
        料,鐵的含量分別有 6、12、18  及 24 ppm 。實驗組再生期用
        含鐵飼料稱為「試驗飼料」,乃以測試樣品提供鐵質,加上「基
        礎飼料」調配而成之一套四種鐵濃度之飼料,使鐵的含量分別為
        6 、12、18  及 35 ppm ,同時測試樣品所提供之熱量營養素應
        從基礎飼料中扣除,使「試驗飼料」之熱量營養素比例與「鐵標
        準飼料」相當。每一種樣品需要一套含四種鐵濃度之「試驗飼料
        」。健康食品若添加含鐵成分,應符合我國「食品衛生管理法」
        、「食品添加物使用範圍與用量標準」等相關法規。
      4.實驗設計
        實驗組別應包括:
     (1)基礎飼料組:6-7 隻 Wistar 鼠,實驗期間全程飼以「基礎飼
          料」。
     (2)標準對照組:共有 4  組,每組採用 6-7  隻 Wistar 鼠,再
          生期間飼以「鐵標準飼料」,每組一種鐵濃度。
     (3)實驗組:每一種樣品需要 4  組動物,每組採用 6-7  隻 Wi-
          star  鼠,再生期間飼以「試驗飼料」,每組一種鐵濃度。
      5.實驗方法及步驟
        根據 AOAC 的標準實驗程序,大鼠採耗鐵期及再生期兩階段飼養
        。動物實驗之流程如圖三所示。
        耗鐵期  全數離乳大鼠餵飼「基礎飼料」,期間每週紀錄動物體
        重,飼養期間可以尾巴採血法採取血樣,測量血紅素濃度以追蹤
        血紅素值變化,直到血紅素降至 6 g/dL 以下,大約需 14 至 2
        1 天。
        再生期  大鼠達到預定之缺鐵貧血程度後,依其體重分組使各組
        平均體重相當,組間沒有顯著差異。取一組餵飼「基礎飼料」。
        取四組餵飼「鐵標準飼料」,每組一種鐵濃度。每一種「試驗飼
        料」需取四組大鼠,每組餵飼一種鐵濃度。再生期間定時紀錄飼
        料攝取量,於第 10 與 14 天秤量體重,並自尾巴採血測量血紅
        素值。
      6.分析項目與方法
        鐵量分析  飼料或測試樣品經灰化後,灰份以濃 HCl  溶解完全
        ,經適當稀釋後,以原子吸收光譜儀配合鐵標準溶液與標準檢量
        線而定量。灰化反應需嚴防鐵污染,所需容器必須泡酸後充分清
        洗方可使用。
        血紅素分析  採用 cyano-methemoglobin  法,以 Drabkin's
        試劑呈色,反應在玻璃或塑膠試管中進行,每個樣品需要二重複
        分析。每支試管中加入 5.0 mL Drabkin's 試劑與全血 20 μl
        ,對照組以蒸餾水替代全血。試劑與樣品充份振盪混合後,靜置
        10 min,以分光光譜儀測量波長 540 nm 之吸光值,經乘以 36.
        8 可得血紅素濃度以 g/dL 表示。
      7.計算與統計分析
        再生期間鐵攝取量以各組飼料鐵濃度乘以飼料攝取重量而得。大
        鼠的血液體積以每公克體重有 0.067 mL 估計,血紅素的含鐵量
        以 0.335  %計算。代表鐵利用之生物指標可採用再生後血紅素
        濃度、再生期血紅素濃度增加量或再生期血紅素鐵增加量,其計
        算原則列於表三。

        表三  血紅素再生法可用的鐵利用率指標
        ────────────────────────────
        鐵可用率相關項目  計算原則
        ────────────────────────────
        血紅素增加量      再生期之血紅素濃度-耗鐵期結束之血紅素
        (mmol/L)        濃度

        血紅素總鐵量      大鼠體重×0.067 ×血紅素濃度×0.335 %
        (μmol Hb/rat)

        血紅素鐵增加量    再生期之血紅素總鐵量-耗鐵期結束之血紅
        (μmol Fe/rat)  素總鐵量

        各組之間各項指標的差異以單因子變方檢定(generalized lin-
        ear model) 後,再以 Duncan's multiple range test分析 。
        將各項鐵利用指標對應飼料添加鐵量或再生期鐵攝取量以 Pear-
        son's correlation test  進行線性迴歸分析,線性關係顯著時
        (p <0.05),計算試驗飼料組對標準飼料組之迴歸係數之比例
        ,作為試驗樣品之相對生物價(RBV ,relative biological v-
        alue)。
      8.結果評定
        若「試驗飼料」各組之鐵利用指標均顯著高於鐵濃度相當之「鐵
        標準飼料」組,而且試驗樣品之相對生物價大於 100  時,表示
        其鐵可用率優於 FeSO4  ,可適用為促進鐵吸收之健康食品。若
        「試驗飼料」各組之鐵利用指標與鐵濃度相當之「鐵標準飼料」
        組無顯著差異或顯著較低,而且其相對生物價低於 100  時,表
        示其鐵可用率不如 FeSO4  ,並不適用為促進鐵吸收之健康食品
        。
(四)人體實驗:血紅素增生法(43)
      1.實驗計劃需遵循我國法規,經研究單位或主管機關之人體實驗審
        查委員會審核同意後始得進行,並遵循臨床實驗之各項規定。受
        試者須聽取研究說明而充分了解實驗條件與目的後,簽訂同意書
        始得參與實驗。健康食品若添加含鐵成分,應符合我國「食品衛
        生管理法」、「食品添加物使用範圍與用量標準」等相關法規。
      2.受試對象:徵求有輕微缺鐵貧血(血紅素濃度 10-11 g/dL ,鐵
        蛋白濃度<12 μg/L)症狀,無懷孕、無任何鐵吸收異常之疾病
        史之婦女,隨機分為實驗組與對照組,各組約 20 名。先進行一
        般常規體檢,測量身高與體重,並抽血以測量紅血球數目(red
        blood cell count, RBC count) 、血比容(hematocrit, Hct
        )、平均紅血球容積(mean corpuscular volume, MCV)、平均
        紅血球血紅素量(mean corpuscular hemoglobin, MCH)、平均
        紅血球血紅素濃度(mean corpuscular hemoglobin concentra-
        tion, MCHC)、血紅素濃度(hemoglobin, Hb)、血清鐵(ser-
        um iron) 、血清運鐵容量(total iron binding capacity)
        運鐵蛋白飽和度(transferrin saturation)與血清鐵蛋白濃度
        (serum ferritin),以供評定其鐵營養狀況。
      3.實驗設計:依產品特性採用雙盲或單盲法進行,並應製備合理之
        「安慰劑」以供利用。實驗組依照產品說明服用「測試食品」,
        對照組則依照產品說明服用「安慰劑」。研究人員應指導受試者
        定期領取測試食品或安慰劑,並且以服用紀錄或其他合理可行之
        指標追蹤服用狀況,確認受試者之合作度。服用時間為連續三個
        月,可視產品特性而延長時間,但不宜超過半年。
      4.受試期飲食管理:受試期間,研究人員應明定受試者之飲食原則
        ,嚴禁服用與實驗無關之含鐵補充劑,以盡量維持日常之飲食習
        慣為宜,並且督導受試者遵行。其飲食狀況應在營養師指導下,
        每個月紀錄三天飲食,以供評估實驗期間之飲食變化。
      5.健康紀錄:受試者每個月測量身高與體重,並記錄各項健康變化
        ,諸如疾病、服藥、月經狀況等等。
      6.血液檢驗:服用測試食品滿 6  週與 12 週時,抽血檢驗紅血球
        數目、血比容、MCV、MCH、MCHC  、血紅素濃度、血清鐵、血清
        運鐵容量與鐵蛋白濃度,以供評定其鐵營養狀況。各項檢驗採用
        臨床檢驗自動分析方法執行。
      7.統計分析:組內各項指標隨服用時間的變化以 paired t-test
        檢測其差異性;各指標的變化量以服用後對服用前之差值表示,
        實驗組與對照組之間各指標變化量的差異性以 student t test
        檢測。統計顯著性以 p<0.05  為檢測標準。
      8.結果評定:測試食品服用前後,平均紅血球容積、血紅素濃度與
        血比容在統計上有顯著的增加,而且此三指標之變化量在實驗組
        顯著高於對照組,即代表該產品具有促進鐵吸收之功能。
   4    
四、參考文獻:
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