健康食品之胃腸功能改善評估方法

 (民國 92 年 11 月 17 日修正)

 

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壹  前言
    消化器官的主要功能是使食物消化,營養素吸收及排便。消化最主要
    是經由消化酵素的作用,自律神經的調節及體液性的調節 (消化管荷
    爾蒙等) 等系統來控制。因此,除了病原菌的侵襲外,各種飲食內容
    的改變及精神壓力或過敏都會引起胃腸道的不適,影響食物的消化及
    營養素的吸收。
    人類的腸道中棲息了約數百種細菌,這些正常菌相的存在,除了可抑
    制有害病菌在腸內孳生及危害外,且可產生人體所需的物質,如維生
    素 B  及 K  等。在人體正常菌相中,包含了有益菌與有害菌,有益
    菌產生的代謝產物 (如乳酸與醋酸) 可抑制有害菌的增殖,對健康的
    維持與整腸方面有相當的幫助。一般健康人體腸道中有害細菌 (如產
    氣莢膜梭菌 Clost idium perfringens) 含量不高,無法危害人體,
    然而身體的不適,飲食及環境的變化、精神壓力、老化等都可能使有
    害菌增加,造成腸內菌相平衡的崩解,進而引起便祕、下痢。
    食品種類繁多,其中部分食品可改善食慾,促進消化酵素的分泌,增
    進胃腸蠕動,增加小腸吸收。食品亦可因含有利腸道益生菌生長的成
    分,或本身含有腸道中的有益細菌,因而具改善腸內菌相的功能。因
    此,若食品具有 (1)  促進消化吸收, (2)  改善腸內細菌菌相, (
    3)  促進胃腸蠕動,幫助維持腸道正常機能等三種功能中任一種功能
    時,可認為具有改善胃腸道功能。
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貳  實驗方法及結果判定
一  評估對胃腸道功能改善之要點與原則:
 (一) 改善胃腸功能必須明確具有以下四種功能指標之ㄧ。
      1 促進消化吸收
      2 改善腸內細菌菌相
      3 幫助 (改善) 胃腸運動
      4 有助於胃黏膜之保護作用
 (二) 所進行的實驗可分為動物實驗與人體實驗,兩者可擇一施行。
 (三) 若廠商所提產品的相關科學研究證據不明確或不足時,須同時進行
      「人體實驗」和「動物實驗」,以加強證據之可信度。
 (四) 動物實驗進行時間至少需 4  星期以上,人體實驗至少需進行 2
      星期以上。
 (五) 所使用的實驗動物以哺乳類動物為原則,動物隻數每組至少為 8
      隻,小白鼠隻數每組至少為 10 隻。
 (六) 實驗動物必須來自各大實驗動物中心。
 (七) 人體實驗每組人數至少為 8  人,且必須有控制組。
 (八) 人體實驗必須由大學食品、營養、醫藥等相關系所、研究機構、醫
      學中心執行,需有醫師參與,並遵循衛生單位對人體實驗有關之相
      關規定。
 (九) 動物實驗進行時,飼料的內容與比例,必須符合 AIN (American
      Institute of Nutrition) 之規範,進行人體實驗的飲食內容與比
      例,必須符合衛生署所公布之飲食指南。
 (一○) 評估對胃腸道功能所採用的實驗方法,必須是學術界或醫學單位
        所採用或普遍認可之方法,亦可使用市售的生化試劑 (Test Kit
      ) 直接測定之。
二  促進消化吸收
 (一) 動物實驗
      1 動物體重的測定及消化吸收率的測定
      2 消化酵素活性的測定:如 trypsin, chymotrypsin, amylase,
        lipase, leucine amino peptidase, disaccharidase。
 (二) 人體實驗:
      1 有關改善食慾不佳方面,觀察食慾、食量、體重、血紅素等指標
        的變化。
      2 有關改善消化吸收不良方面,觀察食慾、食量、胃腸腹脹感、糞
        便形狀及次數、胃腸運動及小腸吸收等指標變化。
 (三) 結果判定:
      1 動物實驗中必須至少一項指標為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05
        ) 。
      2 人體實驗方面,如果是針對改善兒童食慾方面,以食慾、食量的
        改善為觀察重點。體重及血紅素的變化則作為輔助指標。
      3 針對消化吸收不良者,除了有明顯改善食慾、食量,胃腸腹脹感
        及糞便形狀等消化不良症狀外,在小腸吸收指標中至少有一項指
        標為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) 。
      4 如果符合以上要求即可判定測試食品具有促進消化吸收作用。
 (四) 測定方法
      1 消化酵素活性測定
        樣品製備:
        截取實驗老鼠 (Sprague-Dawley或Wistar  品系) 小腸片段,刮
        下腸黏膜 (脂解酵素活性測定不必刮下腸黏膜) ,取 0.2g 加入
        2mL 含 protease 抑制劑 (1 mM phenylmethylsulfonylfluori-
        de  及 2.2 mM iodoacetic acid)  之 4℃、0.9% NaCl 溶液,
        以均質機均質化。
      (1) 雙醣酵素 (disaccharidase) 活性測定
          目的:測定小腸雙醣類消化酵素 (乳糖酵素、麥芽糖酵素與蔗
          糖酵素) 活性。
          測定方法:取 30mL 的腸黏膜均質液加入 15 mL  的 56mM 雙
          醣溶液 (乳糖、麥芽糖或蔗糖) 於 37 ℃下作用 30 分鐘,再
          加入100 mL  的 0.6 N NaOH 溶液溶解細胞,另以 10mL 的 6
          N HCl 溶液中和之。取 45mL 處理過後之腸黏膜液或葡萄糖標
          準液 (0-40 mg/mL) 與 625 mL 反應緩衝液 (50 mM Tris-ma-
          late、33 mM sodium potassium phosphate  與 30 mM MgCl2
          ,pH 6.8) 、150 mL  的 1 mM ATP、150 mL 的 1 mM NADP、
          15 mL 的 330 IU/mL hexokinase (EC 2.7.1.11) 與 15mL 的
          170 IU/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase  (EC 1.1.1
          .49)  於 37 ℃下作用 30 分鐘,最後將樣品置於冰浴上以終
          止其反應。葡萄糖產物含量則以分光光度計於 30 nm  波長下
          測定減少的 NADPH  ,並以改良的 Lowry  方法測定樣品中蛋
          白質含量,而雙醣酵素活性以 mM 葡萄糖/分鐘/㎎蛋白質表
          示之。
      (2) 脂解酵素 (lipase) 活性測定
          目的:測定小腸內脂質消化酵素活性
          測定方法:用市售試劑組 (Sigma Lipase-PSa) 測定之。將 9
          00 mL 受質溶液 (1.1 mM 1,2- diglyceride、2 mM sodium N
          -ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine、0.66
          mM ATP、860 U/L monoglyceride lipase、1340 U/L glycer-
          ol kinase、40,000 U/L glycerol-3-phosphate oxidase、13
          40 U/L horseradish peroxidase、40,000 U/L co-lipase 與
          緩衝液) 加至 15mL 之腸均質液或標準液 (附於試劑組) 中,
          於 37 ℃下作用 3-5  分鐘,再加入 300mL  活化劑 (36 mM
          deoxycholate、6 mM 4-aminoantipyrine、0.05% sodium az-
          ide 與緩衝液) ,於 37 ℃下作用 3  分鐘後,以分光光度計
          於 550 nm 波長下測定2分鐘,並以改良的 Lowry 方法測定樣
          品中蛋白質含量,而脂解酵素活性以 unit/mg  蛋白質表示之
          。
      (3) 白胺酸胺基酵素 (leucine aminopeptidase,LAP)  活性測定
          目的:測定小腸絨毛刷狀緣膜上蛋白質消化酵素活性。
          測定方法:用市售試劑組 (Sigma Diagnosticsa LAP) 測定之
          。取 0.5 mL 腸黏膜均質液,混合 0.5 mL LAP 受質溶液 (20
          mg/dL L-leucyl-b-naphthylamine  溶於 phosphate  緩衝液
          , pH 7.1)  ,於 37oC 下作用 1  小時,再加入 0.5 mL 的
          2 N HCl,1.5 mL 處理過後之腸黏膜液或 1.5 mL 標準液 (0-
          12 Sigma unit/mL)  與 0.5 mL sodium nitrite 溶液,於室
          溫下作用 3  分鐘後,混合 1.0 mL 0.5% (w/v) ammonium s-
          ulfamate  ,於室溫下作用3分鐘,再加入 2.0 mL N-1-naph-
          thylethylenediamine 酒精溶液,於室溫下作用 45 分鐘後,
          以分光光度計於 580 nm 波長下測定吸光值,並以改良的 Lo-
          wry 方法測定樣品中蛋白質含量,而白胺酸胺基之酵素活性以
          Sigma unit/mg 蛋白質表示之。1 Sigma unit  定義為於 37
          ℃、pH 7.1  下,每 1  小時生成 1 mmole b-naphthylamine
          的酵素量。
          判定:以上各一項有改善,表示有改善胃腸消化之功能。
      2 改善胃腸功能之參考指標:
      (1) Lundh 測試 (主要為胰臟功能) :
          使用 300 ml 之流質食物 (含 6  %脂肪、5 %蛋白質及 15
          %醣類) ,並放置十二指腸管,依時段抽取十二指腸液,以測
          定消化酵素之濃度 (如 Trypsin) 或以內視鏡抽取胰液作消化
          酵素之分析。
      (2) Schilling 測試 (主要為胃腸功能)
          -以維生素 B12  之吸收來測定胃腸功能
          -以放射性標示之維他命 B12  給予空腹之受試者
          -一小時後再由肌肉注射未標示 B12
          -24  小時後收集尿液,並測定 B12  含量
          -7 天後重複此步驟,但口服 B12  則加入Intrinsic factor
          -兩次檢查加以比較評估
      (3) 脂肪之吸收判定:
          糞便脂肪分析:
          -正常值:< 7g/day
          -每日食用食物中至少有 100 g  中鏈三酸甘油酯共三天;並
            收集糞便 3  天
          -測定糞便中脂肪含量
          -使用 Sudan stain  ,只可測三酸甘油酯及 lipalytic pr-
            oduct
      (4) D-xylose  耐受測試 (主要為小腸功能) :
          -主要測定近端小腸之醣類吸收
          -隔夜禁食,再服用 25g  之 D-xylose ,5 小時後之尿液中
            若 xylose 排出大於 25 %,即表示正常。
          -1 及 2  小時抽血,若其中一次大人血中 xylose>300 mg/L
            ,或小孩血中 xylose >100 mg/L ,則表示正常。
      (5) 核子醫學檢查
          目前只使用於 gastric emptying study
          -受試者服下含有放射源 (Tc-99m and In-111)  的固體及液
            體食物
          -測量受試者 90 分後的胃排空率
      (6) 放射線科檢查
          小腸排空速度檢測
          -受試者喝下 600 cc barium  後,隔 15 分透視一次,直到
            barium  完全排出ileocecal valve
三  改善腸內細菌菌相
 (一) 動物實驗:
      1 檢測 1  種益生菌:Bifidobacterium
      2 檢測 1  種有害 (或無益) 菌:Clostridium perfringens
 (二) 人體實驗:
      1 檢測 1  種益生菌:Bifidobacterium
      2 檢測 1  種有害 (或無益) 菌:Clostridium perfringens
 (三) 測定方法:
      1 腸內細菌菌相
      (1) 材料
          a 大白鼠:雄性 Spraguae Dawley (SD) 或 Wistar 系統大
              白鼠之盲腸或糞便。
            b 人體糞便。
          培養基
            a 雙叉桿菌 (Bifidobacteria) 參考培養基:
            (a) Bifidobacteria iodoacetate medium -25 (BIM-25)
            (b) MPN medium
            (c) Beerens medium
            b 產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens)  參考培養基
              Tryptose-sulfite-D-cycloserine (TSC) agar
              有關製備請參考各相關參考文獻。
      (2) 方法
          a 取樣及均質
            (a) 動物實驗:以按摩方式收集糞便於密閉容器內 (維持厭
                氧狀態) ,再於厭氧操作箱內秤取約 0.5 g,加入含 4
                .5 mL 無菌厭氧稀釋液 (附註) 之試管中 (內含 5  粒
                玻璃珠) ,以試管震盪器混合。
            (a) -1  大白鼠經餵養試驗後,麻醉,解剖,在厭氧狀況取
                出盲腸 (cecum)  內容物,秤取約 1 g,加入含 9 mL
                無菌厭氧稀釋液之試管中 (內含 5  粒玻璃珠) ,以試
                管震盪器混合。
            (b) 人體試驗:收集糞便於密閉容器內 (維持厭氧狀態) ,
                再於厭氧操作箱內,進行如同上述大白鼠樣品之秤重及
                均質操作。
      2 稀釋及微生物平板分析
        於厭氧狀況下,上述均質液以厭氧稀釋液進行一系列十倍稀釋。
        取適當稀釋倍數,以表面塗抹法 (spread plate method)  或混
        稀平板法 (pour plate method)  加入雙叉桿菌培養基中,置於
        厭氧操作箱或厭氧缸中 (內含厭氧包,或抽氣維持厭氧狀態) ,
        於 35~37 ℃培養,計數菌落數。
        至於產氣莢膜梭菌之計數,請依照美國 FDA  發行的 Bacterio-
        logical Analytical Manual (BAM) 。
      3 統計分析
        實驗數據經統計變異數分析 (Analysis of variance ANOVA) 測
        試各實驗組間是否有差異,若有差異再以鄧肯氏多變試驗 (Dun-
        can,s multiple range test) 作進一步分析,以決定各實驗組
        在 95 %可信度內是否有差異。
 (四) 結果判定
      動物實驗:若盲腸或糞便的 bifidobacteria 明顯增加,以及 Cl-
      ostridium perfringens 減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內
      細菌相功能。
      人體試驗:若 bifidobacteria 明顯增加,以及 Clostridium pe-
      rfringens 減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內細菌相功能。
      附註:厭氧稀釋液之製備如下:
      Gelatin                                              0.2 g
      Distilled water                                      50 mL
      Salts solution (如 2.1.3  中 salts solution 配方)    50 mL
      Resazurin solution (25 mg/100 mL H2O)               0.4 mL
      將各成分混合,煮沸,冷卻,再加入 0.05 g cysteine,以厭氧操
      作分裝入試管中,每一試管裝 9 mL ,以 121  ℃殺菌 15 min ,
      殺菌完成或實驗過程呈粉紅色,請勿使用。
四  幫助 (改善) 胃腸運動,促進腸道正常機能之維持
 (一) 動物實驗:
      1 胃腸運動 (活性碳、腸鋇計檢查或核子醫學檢查)
      2 胃黏膜保護
      3 觀察糞便之乾重、粒數、水分及形狀
 (二) 人體實驗:
      1 腸運動 (腸鋇計檢查或核子醫學檢查)
      2 觀察排便時間,糞便重量、水分及形狀及排便感覺之變化。
 (三) 檢查方法
      胃腸運動測定:
      1 動物實驗
      (1) 離體實驗:擷取絕食老鼠之胃或腸片段約 1-2cm  ,放於組織
          浴 (organ bath) 中並通氣之 (95%O2,5%CO2) ,放置 2hr
          使其穩定而後做等長收縮 (0.5-1 gm) ,視測試食品對於胃或
          腸片段之收縮情況,若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即
          可判定,即可判定測試食品具有改善胃腸運動之功能。
      (2) 活體實驗:動物配置的灌胃溶液灌食 (含有 10 %活性碳及測
          試物) 。而後追蹤計算排空率,活性碳則以黑色易觀察之特性
          作為胃腸排空之另一指標。 30 分鐘後,大白鼠去頭犧牲,隨
          後剪開腹腔以線綁住賁門處,將胃、小腸完整取出,計算胃腸
          排空率,方法如下:

                             charcoal marker
          Charcoal Transit=──────────× 100%
                             Intestinal length
      2 人體實驗
      (1) 核子醫學檢查:目前只使用於 gastric emptying study
          -讓病人服下含有放射源 (Tc-99m and In-i11)  的固體及液
            體食物
          -測量病人 90 分後的胃排空率
      (2) 放射線科檢查:小腸排空速度檢測
          -請病人喝下 600 cc 鋇鹽 (barium salt)  後,隔 15 分透
            視一次,直到鋇鹽完全排出迴腸辮 (ileocecal valve)  。
 (四) 結果判定:糞便重量或粒數明顯增加,再加上胃腸運動實驗或排便
      時間中有任何一項結果為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即可
      判定測試食品具有潤腸通便之功能。
五  有助於胃黏膜之保護作用,維持腸道正常機能
 (一) 實驗內容:
      1 離體實驗:培養鼠胃黏膜細胞,先將測試物至於胃黏膜細胞內,
        培養 2  小時,而後置入酸性培養液 (pH=4) 或含 indomethac-
        in  之培養液下。測定胃黏膜細胞之存活率 (viabiliy) 的變化
         (MTT assay)  ,若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即可判
        定測試食品具有保護作用之功能。
      2 活體實驗:胃酸的分泌測定:Shay  潰瘍法  (Shay's ulcer)
        雄性實驗絕食老鼠 (24  小時) ,胃部幽門結紮,再予以縫合復
        原,俟 4  小時候,將其犧牲取出胃部,收集胃液並定量胃液體
        積,並以 01N NaOH 溶液滴定,求其實驗組及控制組之總酸度之
        變化若 p<0.05 ,即可判定測試食品具有胃黏膜保護作用之功能
        。
   (二) 結果判定:任何一項結果為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,
        即可判定測試食品具有幫助胃黏膜保護之功能。
六  減少胃內幽門螺旋桿菌
(一)受試者的篩選
      1 志願參與者先填寫一份問卷,包括個人飲食、生理習慣及健康狀
        況(含是否有慢性病,需要隨時服藥等)。
      2 體檢,包括醫生問診、體位測驗、及血液生化檢查(含血紅素、
        血球比容、血糖、血脂肪、肝功能及腎功能)。
      3 依據前兩項的資料,篩去習慣特異及健康不良的參與者。然後填
        寫志願書,進行尿素呼氣試驗(urea breath test),以得 13
        CO2 /12CO2  比值(即ΔUBT 值)。就ΔUBT 值決定受試對象(
        建議ΔUBT>10%O  者)。
(二)實驗方法
      1 受試者在實驗開始前三週每四天測一次ΔUBT 值,以觀察其日常
        飲食是否影響該值;並計算其平均值,以作為實驗開始後的比較
        。
      2 每位受試者於實驗前必須接受飲食指導。實驗開始前須經 2~3
        週之穩定期,於穩定期間應按其個人之原飲食習慣攝食,並避免
        暴飲暴食或其他特殊食物之攝取,且亦不可服用整腸健胃藥物、
        補充劑、抗生素、組織胺-2  拮抗劑、抗氧化劑、強調整腸健胃
        的機能性食品,或其他不明藥物等。並於該其間進行幽門螺旋桿
        菌之測試,而獲得至少最後之 3  次為近似恆定值,其平均值作
        為實驗之起始值(initial value) 。
      3 實驗期間(最少二週)的飲食按上述穩定期間之條件進食,且加
        食試驗品穩定與實驗期間定期測量其ΔUBT 值、血液生化檢查、
        體檢、與問卷調查,以瞭解其實驗期間健康情形及身體的感覺。
      4 ΔUBT 值測定:受試者在受試前一天晚上 10 點以後禁食,次晨
        刷牙、漱口,靜坐 5  分鐘後飲用 200 mL 的 0.1N 檸檬酸溶液
        ,漱口、靜坐 10 分鐘後,吹氣至 2  支 10 mL  的氣體收集管
        。再靜坐 5  分鐘後飲用 50 mL  含 13C  標識的尿素(50mg)
        溶液,再漱口、靜坐 10~20 分鐘後,吹氣至 2  支 10mL 的氣
        體收集管。所收集的氣體以 isotope ratio mass spectrometer
        (IRMS)分析其ΔUBT 值。
(三)結果判定
      1 若受試者之ΔUBT 值於實驗後比實驗前有明顯(p<0.05) 降低
        ,則表示該試驗品具有減少幽門螺旋桿菌之生理功能。
      2 經體檢及問卷調查結果,若於實驗期間及實驗後一週沒有明顯不
        舒服的感覺或其他健康問題,特別是腸胃道問題,則可判斷該試
        驗品沒有安全上的問題。

參考文獻
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